¿Cuál es el principio del uso de vectores dirigidos para preparar ratones knockout?
El descubrimiento de la recombinación homóloga en biología ha sentado una base teórica sólida para la orientación genética, y el desarrollo de la tecnología de células madre embrionarias ha promovido la aplicación generalizada de la orientación genética. La recombinación homóloga, también conocida como recombinación general o recombinación no específica, se refiere al proceso de intercambio de información genética entre fragmentos de ADN exógenos similares que pueden intercambiarse con fragmentos correspondientes del genoma del huésped (es decir, recombinación). La orientación genética generalmente se refiere a la introducción de tecnología de ADN exógeno mediante la recombinación homóloga de un fragmento de ADN con una secuencia conocida y un gen con la misma secuencia o similar en el genoma de la célula receptora, e integrándolo y expresándolo en el genoma del receptor. celúla.
Estrategias principales:
(1) Estrategia de eliminación genética completa
El vector PNS sigue siendo la estrategia más utilizada para la selección genética de células madre embrionarias. Con la ayuda de genes marcadores de selección positiva, el gen diana generalmente se inserta en el exón más crítico de la función, o el dominio funcional más importante del gen diana se elimina mediante recombinación homóloga, de modo que el gen diana se elimina por completo.
(B) Captura de genes knockout aleatorios a gran escala
El uso de la captura de genes para establecer una biblioteca de células ES de mutaciones insertadas aleatoriamente puede ahorrar una gran cantidad de pruebas de detección y construcción de bibliotecas genómicas. de objetivos específicos y el costo del vector, lo que permite un análisis más eficiente y rápido de la función del genoma del ratón. Además, otra desventaja del método de captura de genes knockout es que no puede llevar a cabo una modificación genética fina del gen.
(3) Introducción de mutaciones finas
Muchas enfermedades humanas son causadas por la pérdida de la función genética, y muchas son causadas por la sobreexpresión o ganancia de función del gen. Para este último, el modelo de enfermedad correspondiente no se puede obtener utilizando métodos de eliminación de genes. Para ello, los investigadores han desarrollado diversos métodos para introducir mutaciones sutiles, como la inserción de codones de parada o la sustitución de aminoácidos en el genoma del ratón.
(1) Estrategia de golpear y huir, también conocida como estrategia de avance y retirada.
(2) Método de doble reemplazo
(3) Método "Marcar y reemplazar"
(4) Introducción de mutaciones puntuales a través del sistema Cre-LoxP.
Proceso principal:
Primero, se obtiene la línea de células ES y se obtiene el medio de cultivo mutante de células ES objetivo diseñado por el investigador mediante tecnología de recombinación homóloga.
Las células ES modificadas genéticamente se introducen en el embrión receptor mediante microinyección o fusión embrionaria.
Las células ES genéticamente modificadas aún mantienen la totipotencia de diferenciación y pueden convertirse en células germinales de animales quiméricos, permitiendo que la información genética modificada se transmita a través de la línea germinal.
Los animales mutantes obtenidos con modificaciones específicas proporcionan a los investigadores un sistema de investigación especial que les permite estudiar la función de genes específicos en organismos vivos.