Le pregunté a mi hermano mayor cómo purificar los cuerpos de inclusión y me dijo...
Le pregunté a mi hermano mayor cómo hacer que la proteína fuera más pura y solo me dijo esto... Hardcore | Notas sobre cultivo celular: Cómo leer un documento de forma intensiva: cómo elegir un. proteína fluorescente adecuada
En el camino hacia la expresión y purificación de proteínas, siempre hay varios desafíos: o la proteína no se puede expresar o la proteína expresada no se puede detectar... especialmente cuando se incluye la proteína purificada. cuerpos y es insoluble, ¿qué debemos hacer si no colgamos los pilares? Por lo tanto, si dedica algún tiempo en la etapa inicial a optimizar el diseño experimental, ahorrará mucho tiempo y problemas innecesarios en la purificación posterior. Por ejemplo, para purificar los cuerpos de inclusión, primero es necesario entender...
¿Qué son los cuerpos de inclusión?
Comúnmente conocidos como cuerpos de inclusión (IB), se refieren a agregados de proteínas amorfas y no cristalinas expresadas en bacterias (o células procarióticas)1. Cuando las proteínas recombinantes se expresan en E. coli, aproximadamente el 70% de las proteínas recombinantes están presentes como cuerpos de inclusión2. Los cuerpos de inclusión no tienen actividad biológica y son difíciles de disolver en agua, pero son solubles en disolventes desnaturalizados como urea, clorhidrato de guanidina, etc. 1 . Una vez disueltos los cuerpos de inclusión, el sobrenadante correspondiente se puede centrifugar y purificar.
En la actualidad, además del método de intercambio iónico y el método hidrófobo, la cromatografía de afinidad es un método de purificación de cuerpos de inclusión ampliamente utilizado. Una vez marcada la proteína, puede unirse específicamente al medio de cromatografía conectado al ligando, separándolo y purificándolo así. Entre las muchas etiquetas de purificación, hay dos etiquetas que se pueden utilizar para purificar proteínas en condiciones desnaturalizantes: His-tag y Strep-tag. Ambas etiquetas se usan comúnmente en la expresión de proteínas recombinantes. En cuanto a la comparación entre las dos, aquí hay una tabla para su referencia:
(Fuente de la imagen: Expresión de células de mamíferos. Las dificultades y soluciones se han resuelto para usted. )
Para comparar los efectos de purificación reales de las dos etiquetas, se realizaron dos pequeñas pruebas aquí. Recombine mCherry, GAPDH o la proteína objetivo con His6-tag y Twin-Strep-tag? en condiciones nativas y condiciones desnaturalizantes, respectivamente, purifique en las condiciones de purificación respectivas de las dos etiquetas y ejecute geles para observar los resultados.
En términos de selección de ligandos, la proteína recombinante His6-tag se purificó usando Ni-NTA, mientras que la proteína recombinante Twin-Strep-tag? Alemania) para su purificación.
(Fuente de la imagen: iba)
El sistema de purificación de proteínas de alta eficiencia Strep-tag? de tercera generación (como se muestra a continuación) es una combinación de Twin-Strep-tag? Strep-Tactin? Figura), tiene una alta afinidad cercana al precio ***.
(Fuente de la imagen: iba)
Protocolo
Clonación y expresión
1. Clonar la codificación de mCherry, GAPDH y la proteína objetivo en In se construyeron el vector de expresión (IBA Lifesciences), los vectores de expresión de proteínas recombinantes Twin-Strep-tag? y His6-tag, y luego los vectores se transformaron en E. coli BL21 respectivamente, se expresaron y se recolectaron (Protocolo PR86-0001 de IBA Lifesciences). Cultivar los talos en medio LB o HD que contenga ampicilina e inducir a la densidad óptica adecuada. 2. Recoger las células y resuspenderlas en tampón. Las proteínas recombinantes con etiqueta His utilizan tampón de lisis Ni-NTA (NaH2PO4 50 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM); las proteínas recombinantes con etiqueta Twin-Strep utilizan tampón W (Tris/HCl 100 mM, pH 8,0, 150 mM); NaCl; utilizar EDTA 1 mM). 3. Disturbe y centrifugue ultrasónicamente.
Purificación
"Condiciones nativas: mCherry, GAPDH"
1. Utilice Ni-NTA Lysis Buffer y Buffer W para equilibrar 1 ml de Ni-NTA, Strep -¿Tactina? y ¿Estreptoctina? 2. Utilice 2 VC (volumen de columna, volumen de columna) de tampón de lavado Ni-NTA (NaH2PO4 50 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM) para lavar la columna de Ni-NTA 4 veces y 1 VC de tampón W para separe los dos Strep -Tactin? Limpieza de la columna 8 veces. 3. Lavar 6 veces con eluyente de 0,5 CV.
Eluyente: Ni-NTA: NaH2PO4 50 mM pH 8,0 NaCl 300 mM Imidazol Strep-Tactin?250 mM: Tampón E (Tampón W + Destiobiotina 2,5 mM) Strep-Tactin?XT: Tampón BXT (Tampón W + biotina 50 mM)
Condiciones de desnaturalización: proteína diana
1. A temperatura ambiente, el sedimento celular se disuelve en el tampón con agitación continua durante 15 a 60 minutos, y luego se centrifuga. . Tampón: Tampón W: (contiene urea 8 M, ¿Twin-Strep-tag?) Tampón B: (NaH2PO4 100 mM, pH 8,0, Tris/HCl 10 mM, urea 8 M; etiqueta His) 2. Antes de cargar la columna, utilice el tampón W La proteína solubilizada se diluyó hasta concentraciones de urea de 4 M y 6 M para la purificación de Strep-Tactin® y Strep-Tactin®XT. 3. Equilibre la columna de purificación con 1 ml de Ni-NTA, Strep-Tactin® y Strep-Tactin® XT usando un tampón de lavado que contenga la concentración adecuada de urea. Tome el sobrenadante que contiene la proteína y agréguelo a la columna. 4. Utilice 1 CV de tampón W o tampón C que contenga urea para limpiar la columna de purificación y lave repetidamente hasta que A 280 nm sea inferior a 0,1 o alcance un valor constante. 5. Lavar 6 veces con eluyente 0,5 CV. Eluyente: Ni-NTA: Tampón D1: NaH2PO4 100 mM, pH 5,9, Tris/HCl 10 mM Urea 8 M: Se usó tampón D2 (Tampón D1 a pH 4,5) para el segundo paso de elución. ¿Estrep-tactina?: ¿Tampón E + urea estreptoctina?
Resultados
Al comparar el análisis SDS-PAGE, se puede encontrar que el sistema Strep-tag tiene un proceso simple y la pureza de las proteínas purificadas en condiciones nativas o desnaturalizantes es mayor que la del sistema Strep-tag. el del sistema His-tag.
– Compare el rendimiento del sistema Strep-tag® de tercera generación (izquierda) y el sistema His-tag (derecha) en condiciones nativas para purificar las proteínas mCherry y GAPDH
Si es mCherry o GAPDH, usando Strep-tactin?XT: Twin-Strep-tag? puede obtener una proteína objetivo de mayor pureza (ver Elución).
Los resultados del análisis Western blot muestran que las impurezas que aparecen en la extracción de mCherry son sus productos de degradación.
(Fuente de la imagen: iba)
Compare el sistema His-tag (izquierda) con los sistemas Strep-tag de segunda y tercera generación (centro, derecha) El efecto de purificar diferentes proteínas en condiciones desnaturalizantes
¿Utilizando la Strep-tactina de tercera generación? ¿Solo se puede obtener una cantidad muy pequeña de proteína?
Aunque el uso de Ni-NTA puede purificar proteínas bajando el valor del pH a 4,5 (E2), el producto final todavía contiene muchas impurezas.
(Fuente de la imagen: iba)
Por lo tanto, en conjunto, podemos encontrar que las proteínas Strep-Tactin? son de alta pureza.
Operacionalmente, el sistema His-tag requiere dos tipos de Buffers con diferente pH durante la elución. ¿Los pasos de operación de Strep-Tactin? ¿Más datos muestran que Strep-Tactin? Este sistema de purificación también tiene un buen rendimiento de purificación en un entorno con tensioactivos. La columna se puede lavar varias veces sin provocar la pérdida de la proteína objetivo. Incluso pequeñas cantidades de proteínas o proteínas de membrana tienen una buena eficacia de purificación.
(Fuente de la imagen: iba)
Al mismo tiempo, las proteínas Strep-Tactin?, que detectan interacciones entre proteínas o se utilizan además para detectar proteínas terapéuticas, enzimas industriales, etc. una amplia gama de aplicaciones. (Fuente de la imagen: iba) Referencias: 1. Palmer I, Wingfield PT, 2004: Curr Protoc Protein Sci 38:6.3:6.3.1–6.3.18. Preparación y extracción de proteínas insolubles (cuerpos de inclusión) de Escherichia coli. 2. Yang Z, Zhang L, Zhang Y, Zhang T, Feng Y, Lu X, et al. (2011) Producción altamente eficiente de proteínas solubles a partir de cuerpos de inclusión insolubles mediante un método de replegamiento y desnaturalización en dos pasos. (7): e22981. doi/10.1371/journal.pone.0022981 Fuente del artículo: iba Fuente de la imagen del título: Zukuuhailuo Tema: Cuerpos de inclusión, proteínas