Preguntas del examen de bioquímica
En las condiciones del tampón de electroforesis de pH 4,8, después de la disociación de AMP, ADP y ATP con diferentes cantidades de grupos fosfato, el orden de carga negativa es: ATP>ADP>AMP. Se mueven a diferentes velocidades. velocidades en el campo eléctrico, lo que resulta en la separación. Aprovechando las propiedades de absorción ultravioleta de las bases de las sustancias nucleotídicas, la película de acetato electroforética separada se colocó bajo una lámpara UV y se observaron manchas de color rojo oscuro en referencia a la electroforesis de la muestra estándar en las mismas condiciones que la muestra mezclada. Separado Cada componente está identificado.
3. Instrumentos y reactivos
1. Instrumentos
(1) Aparato de electroforesis, tanque de electroforesis (tipo placa plana)
(2) Lámpara ultravioleta
(3) Secador de pelo, pinzas médicas
(4) Película de acetato de celulosa (8 cm×12 cm)
(5) Microinyector (10μL o 50μL)
2. Reactivos
(1) Tampón de ácido cítrico (pH 4,8): Pesar 8,4 g de ácido cítrico y 17,6 g de citrato de sodio, disolver en agua destilada y diluir a 2000 ml.
(2) Solución estándar de adenilato: utilice agua destilada para preparar AMP, ADP y ATP puros en soluciones de 100 mg/10 ml. Entre ellos, el AMP debe calentarse ligeramente para ayudar a disolverse. Guárdelo en el refrigerador para su uso posterior.
(3) Mezcle la solución de adenilato: tome 1 parte de cada una de las soluciones estándar anteriores AMP, ADP y ATP y mézclelas en cantidades iguales. Guárdelo en el refrigerador para su uso posterior.
4. Pasos de la operación
1. Manchado: Coloque la membrana de acetato de celulosa en un tampón de ácido cítrico de pH 4,8. Después de que la membrana esté completamente empapada (aproximadamente 0,5 h), sáquela con unas pinzas, colóquela entre papel de filtro limpio, absorba suavemente el exceso de tampón e identifique cuidadosamente el mate. lado de la película y use un microinyector para detectar el lado mate. El punto de muestreo está a 1,5 cm de un extremo de la película y la distancia entre los puntos de muestreo es de 1,5 cm. El volumen de manchado es de 2 a 3 μL y el manchado se completa de 2 a 3 veces según el principio de pequeñas cantidades y varias veces.
2． Electroforesis: Inyecte tampón de ácido cítrico con pH 4,8 en los dos tanques de electroforesis. La altura del tampón es aproximadamente 3/4 de la profundidad de los tanques de electroforesis. (Nota: los niveles de líquido de electroforesis en los dos tanques son consistentes). Utilice un papel de filtro con el mismo ancho que la membrana como "puente de papel de filtro" para conectar la membrana de acetato de celulosa y el tampón bipolar. Después de que el tampón haya empapado completamente el papel de filtro, coloque el lado mate de la película manchada hacia abajo sobre el "puente de papel de filtro" del soporte del tanque de electroforesis.
Coloque el extremo manchado en la dirección del electrodo negativo, cubra el tanque de electroforesis, encienda la alimentación y realice la electroforesis con una caída de voltaje de 10 V/cm. Después de una hora, apague la alimentación y. Saque la película de acetato de celulosa. Seque con un secador de pelo.
3. Identificación: use pinzas para colocar con cuidado la película seca debajo de una lámpara UV para observarla, use un lápiz para dibujar cada punto de electroforesis de adenilato y marque el código de adenilato de cada punto.
Dibuje los patrones de electroforesis de tres nucleótidos estándar y la muestra, y utilice la movilidad del nucleótido único estándar como estándar para identificar cada componente de la muestra.
V.Notas
1. Antes de la electroforesis, asegúrese de verificar la dirección de los electrodos positivo y negativo y de la película, y asegúrese de que el electrodo negativo esté conectado al extremo de la muestra de la película. Debido a que la muestra está cargada negativamente, después de encender la energía, la muestra. La muestra debe flotar sobre la película hacia el electrodo positivo; asegúrese de que la película esté libre de carga.
2． Al realizar la detección, se debe controlar el tamaño de la mancha para que tenga entre 2 y 3 mm de diámetro. La mancha no debe ser demasiado grande, de lo contrario los resultados de la observación después de la electroforesis no serán ideales.