El principio de extracción del genoma de los insectos es
Se utilizó el método CTAB mejorado para extraer el ADN del genoma del insecto.
Reactivos principales
1. Proteinasa K [Merck, EE.UU.]
2. Tris (Tris) [Amresco, EE.UU.]
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3. Taq ADN polimerasa y dNTPs [NEB Company]
4. Agarosa y bromuro de etidio (EB) [Amresco Company, EE. UU.]
5 . Na2EDTA) [American Amresco Company]
6. Fenol, cloroformo, alcohol isoamílico, etanol absoluto, etc. [grado analítico nacional]
7. Tampón de electroforesis TBE: solución de almacenamiento concentrada 5. ×TBE: 54,0 g de base Tris, 57,1 g de ácido bórico, 20 ml de EDTA 0,5 M, pH=8,0, añadir agua destilada para llevar el volumen a 1 L, la solución de trabajo se diluye 0,5×TBE
Principal equipo
1. Centrífuga refrigerada de alta velocidad (3K-30) [Sigma Company, Alemania]
2. Baño de agua a temperatura constante [Beijing Liuyi Instrument Factory]
p >3. Instrumento de electroforesis [Bio-Rad Company, EE. UU.]
4. Tanque de electroforesis horizontal [Bio-Rad Company, EE. UU.]
5. Doc EQ) [Bio-Rad Company de los Estados Unidos]
6. Refrigerador de 4 ℃, -20 ℃ [Sanyo Company de Japón]
7. )[ Japan Sanyo Company]
8. Autoclave [Japan Sanyo Company]
Materiales experimentales
Bemisia tabaci adulta
Pasos del experimento
Método CTAB mejorado para extraer ADN del genoma de insectos:
1. Agregue 50 l de tampón TE para suspender completamente la muestra de células;
2. 10 de solución de SDS, 10 µL de proteinasa K de 20 mg/mL, mezclar suavemente e incubar a 37°C durante 1 hora;
3. Agregar 100 µL de solución de NaCl de 5 mol/L, hacia arriba y hacia abajo. Invierta el tubo de centrífuga más de diez veces y mezcle bien;
4. Agregue 80 µL de solución de CTAB/NaCl, mezcle suavemente e incube a 65 °C durante 10 minutos;
5 Agregue 700 µL de cloroformo/alcohol isoamílico, mezcle suavemente y centrifugue a 12000 r/min durante 2 minutos;
6. Aspire el sobrenadante a otro tubo de centrífuga limpio, agregue un volumen igual de fenol/cloroformo. / Alcohol isoamílico, mezclar invirtiendo boca abajo y centrifugar a 12000 r/min durante 2 minutos;
7. para precipitar el ADN, y mezclar bien suavemente;
8. Centrifugar (12000 r/min, 30 min, 4°C) y eliminar completamente el sobrenadante;
9. 300 ?L 70 etanol preenfriado Precipitar, centrifugar (12000 r/min, 15 min, 4°C), descartar el sobrenadante, centrifugar nuevamente durante unos segundos, usar una pipeta para eliminar completamente el alcohol y secar al aire;
10. Disolver el precipitado en 100?L de solución TE, almacenado a -20°C;
11. Utilizar espectrofotometría UV y electroforesis en gel de agarosa 0,8 para detectar la concentración y la calidad del ADN.
Concentración y purificación de ADN:
1. Coloque la muestra en un tubo de centrífuga de 1,5 ml, agregue un volumen igual de solución de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico a cada muestra, agite la muestra. en el tubo para mezclarlo con un líquido lechoso;
2. Centrifugar a 12000 r/min durante 1 minuto a temperatura ambiente;
3. tubo de centrífuga, agregue nuevamente un volumen igual de solución de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico, mezcle bien y centrifugue a 12000 r/min durante 1 min a temperatura ambiente;
4. a otro tubo de centrífuga limpio, agregue un volumen igual de éter saturado con agua, mezcle bien y deje reposar durante 5 minutos hasta que se separen la fase orgánica y la fase acuosa, deseche el éter sobrenadante;
5. Incubar a 68°C durante 10 minutos. Utilice los dedos para golpear la pared del tubo de vez en cuando para evaporar completamente el éter.
6. /L, pH 5,2), e invierta el tubo de centrífuga hacia arriba y hacia abajo para mezclar bien la solución;
7. Agregue exactamente 2 veces el volumen de etanol absoluto preenfriado, mezcle invirtiendo hacia arriba y. abajo y dejar reposar a -20°C durante 1 hora para permitir que el ADN precipite completamente;
8 Centrifugar a 12000 r/min durante 10 minutos a 4°C y desechar el sobrenadante
9. Añadir etanol preenfriado al 70% a 2/3 del volumen del tubo, mezclar y enjuagar para eliminar la sal residual y centrifugar a alta velocidad (4°C, 12000 r/min, 5 min). ), desechar el sobrenadante;
10. Déjelo a temperatura ambiente durante unos 15 minutos para evaporar completamente el etanol, agregue un volumen apropiado de agua bidestilada o solución de TE para redisolver la precipitación de ADN.