¿Cuál es el principio de la tecnología PCR?

Principio de PCR:

La replicación semiconservativa del ADN es una forma importante de evolución y generación biológica. El ADN bicatenario puede desnaturalizarse y desenrollarse en hebras individuales bajo la acción de diversas enzimas. Con la participación de la ADN polimerasa, se copia en dos copias moleculares idénticas según el principio de apareamiento de bases complementarias.

En experimentos, se descubrió que el ADN puede desnaturalizarse y descomprimirse a altas temperaturas, y puede renaturalizarse en dobles hebras cuando se reduce la temperatura. Por lo tanto, al controlar la desnaturalización y renaturalización del ADN mediante cambios de temperatura, agregando cebadores diseñados, ADN polimerasa y dNTP, se puede completar la replicación in vitro de genes específicos.

Sin embargo, la ADN polimerasa estará inactiva a altas temperaturas, por lo que se debe añadir nueva ADN polimerasa para cada ciclo, lo que no sólo es engorroso de operar, sino también costoso, lo que restringe la aplicación y el desarrollo de la PCR. tecnología.

El descubrimiento de la enzima ADN polimerasa termoestable-Taq es un hito para la aplicación de la PCR. La enzima puede soportar altas temperaturas superiores a 90°C sin volverse inactiva. No es necesario añadir enzima en cada ciclo. Hace que la tecnología de PCR sea muy simple y reduce en gran medida el costo. La tecnología de PCR puede usarse ampliamente y aplicarse gradualmente en la práctica clínica.

El principio básico de la tecnología PCR es similar al proceso de replicación natural del ADN, y su especificidad se basa en cebadores oligonucleotídicos que son complementarios a ambos extremos de la secuencia objetivo. La PCR consta de tres pasos de reacción básicos: desnaturalización - hibridación - extensión:

① Desnaturalización del ADN molde: después de que el ADN molde se calienta a aproximadamente 93 °C durante un cierto período de tiempo, el ADN molde se duplica. -cadenado o amplificado por PCR El ADN bicatenario formado por amplificación se disocia y se convierte en una sola hebra para que pueda unirse al cebador y prepararse para la siguiente ronda de reacción. renaturalización) del ADN molde y el cebador: el ADN molde se Después de calentar y desnaturalizar en una sola hebra, la temperatura desciende a aproximadamente 55 °C y el cebador se empareja con la secuencia complementaria de la hebra única del ADN molde;

③ Extensión del cebador: la combinación plantilla de ADN-cebador se calienta a 72 °C, el ADN bajo la acción de la polimerasa (como la ADN polimerasa Taq), se utiliza dNTP como materia prima de reacción y la secuencia objetivo se utiliza como plantilla. De acuerdo con el principio de emparejamiento complementario de bases y replicación semiconservativa, se sintetiza una nueva cadena de replicación semiconservadora complementaria a la cadena de ADN molde. A través de los tres procesos de desnaturalización-recocido-extensión cíclica, se obtienen más "cadenas de replicación semi-retenidas". " se puede obtener, y esta nueva hebra puede convertirse en una plantilla para el siguiente ciclo.

Cada ciclo tarda de 2 a 4 minutos en completarse, y el gen objetivo a amplificar puede amplificarse millones de veces en 2 a 3 horas.

Información ampliada:

Características de la reacción de PCR:

1. Fuerte especificidad

Los determinantes específicos de la reacción de PCR son:

① La combinación específica y correcta de cebadores y ADN molde;

② El principio de emparejamiento de bases

③ La fidelidad de la reacción de síntesis de la ADN polimerasa; >

④Especificidad y conservación de genes diana.

La combinación correcta de primer y plantilla es la clave. La unión de los cebadores a las plantillas y la extensión de las cadenas de los cebadores siguen el principio del apareamiento de bases. La fidelidad de la reacción de síntesis de la polimerasa y la resistencia a altas temperaturas de la TaqDNA polimerasa permiten que la combinación (renaturalización) de la plantilla y el cebador en la reacción se lleve a cabo a una temperatura más alta. La especificidad de la combinación aumenta considerablemente y se amplifica. El fragmento del gen objetivo también puede mantener un alto grado de precisión. Al seleccionar regiones genéticas objetivo con alta especificidad y conservación, el grado de especificidad será aún mayor.

2. Alta sensibilidad

La cantidad de producto de PCR generado aumenta exponencialmente y puede amplificar la plantilla inicial a probar en el orden de picogramos (pg=10-12). al nivel de microgramos (μg=-6). Puede detectar una célula objetivo entre 1 millón de células; en la detección de virus, la sensibilidad de la PCR puede alcanzar 3 RFU (unidades formadoras de placa, en bacteriología, la tasa de detección mínima es de 3 bacterias);

3. Simple y rápido.

La reacción de PCR utiliza ADN polimerasa Taq resistente a altas temperaturas. Después de agregar la solución de reacción de una vez, se coloca sobre la solución de amplificación de ADN. y el baño de agua Llevar a cabo la reacción de desnaturalización-hibridación-extensión y generalmente completar la reacción de amplificación en 2 a 4 horas.

Los productos de amplificación generalmente se analizan mediante electroforesis, que no requiere necesariamente el uso de isótopos. No hay contaminación radiactiva y es fácil de promover.

4. Requisitos de pureza bajos

No es necesario aislar virus o bacterias y se pueden utilizar tanto ADN como ARN crudos como plantillas de amplificación. Se puede utilizar directamente para la detección de amplificación de ADN en muestras clínicas como sangre, líquido de cavidades corporales, líquido de lavado, cabello, células y tejidos de biopsia.

Referencia: Enciclopedia Baidu----Reacción en cadena de la polimerasa