Cómo realizar el análisis de metilación del ADN
Los principales métodos para detectar la metilación de genes son los siguientes:
PCR específica de metilación (MSP)
El ADN genómico utilizado se trata con bisulfito y todo el ADN genómico no metilado las citosinas se convierten en uracilo, mientras que las citosinas metiladas permanecen sin cambios; luego se diseñan cebadores para apuntar a secuencias metiladas y no metiladas para la PCR. El producto de amplificación de MSP se detecta mediante electroforesis. Si el fragmento amplificado se puede obtener utilizando un cebador dirigido a la cadena de ADN metilado después del tratamiento, significa que hay metilación en el sitio detectado; de lo contrario, significa que no hay metilación en el sitio detectado. .
2. Secuenciación por PCR con bisulfito (BSP)
Utilizando bisulfito para tratar el ADN genómico, la citosina no metilada se convierte en uracilo, mientras que la citosina metilada permanece sin cambios. Luego, los cebadores BSP se diseñan para la PCR. Durante el proceso de amplificación, todo el uracilo se convierte en timina. Finalmente, la secuenciación del producto de la PCR puede determinar si el sitio CpG está metilado, lo que se denomina método de secuenciación directa BSP. Clonar el producto de PCR en un vector y luego secuenciarlo puede mejorar la tasa de éxito de la secuenciación. Este método se denomina método de secuenciación de clonación BSP.
3. Polimorfismo amplificado sensible a la metilación
(Polimorfismo amplificado sensible a la metilación, MSAP)
MSAP utiliza la sensibilidad a la metilación del ADN Dos isosquiasas, Hpa II y Msp I , se utilizan para escindir y ligar ADN genómico. Porque ambas enzimas reconocen el mismo sitio de la enzima de restricción, el sitio CCGG. Cuando los sitios CCGG en la secuencia de ADN tienen diferentes grados de estado de metilación, estas dos enzimas los reconocerán respectivamente y se reflejarán en la presencia o ausencia de productos.
4. Pirosecuenciación
Al cuantificar con precisión la frecuencia de metilación en un único sitio CpG continuo, la pirosecuenciación puede detectar y cuantificar cambios leves. Durante el proceso de extensión de secuencia, la relación C-T de un solo sitio se determina cuantitativamente en función de la incorporación de C y T. Por lo tanto, se pueden detectar con precisión variaciones de metilación en diferentes sitios. Dado que la pirosecuenciación proporciona datos de secuencia reales, el estado de metilación también se presenta en forma de secuencia.