Estrategia de construcción y optimización de líneas celulares CHO que expresan anticuerpos

Los anticuerpos se utilizan ampliamente en la investigación biomédica, el diagnóstico y el desarrollo de tratamientos, y tienen una gran demanda. Sin embargo, satisfacer la creciente demanda de anticuerpos en el mercado global es un enorme desafío. Para mantener el equilibrio entre la oferta y la demanda de anticuerpos, los científicos han inventado mejores métodos para optimizar la expresión de anticuerpos para aumentar la expresión de anticuerpos por volumen y reducir los costos de producción. La expresión de anticuerpos se ha beneficiado enormemente de los nuevos métodos de clonación, técnicas de modificación genética y una variedad de tecnologías de ingeniería celular y de vectores, así como de mejoras en la tecnología de fermentación.

Las células de mamífero son el principal sistema de expresión utilizado en productos farmacéuticos de anticuerpos clínicos, e incluyen principalmente células de mieloma Sp2/0, células de mieloma de ratón NS0, células de riñón embrionario humano HEK293 y células de hámster chino CHO. el más utilizado.

¡Haixing Bio está comprometido con la construcción y transformación de líneas celulares de ingeniería, acelerando la investigación científica y potenciando la industria!

¿Linaje de células CHO?

Ventajas de las células CHO

1. Las células CHO tienen antecedentes genéticos claros, no son fáciles de transmitir virus humanos y son altamente seguras. El uso de CHO como célula huésped para expresar proteínas biológicas puede ser aprobado fácilmente por agencias de revisión de medicamentos, como la FDA.

2. Las células CHO se pueden adaptar a cultivos en suspensión sin suero mediante la aclimatación de la suspensión, y pueden. se puede lograr en un medio sin suero. El crecimiento rápido y de alta densidad brinda gran conveniencia y beneficios para el control de calidad y la producción a gran escala de medicamentos;

3. Las proteínas recombinantes expresadas en células CHO se pueden traducir de manera similar a Proteínas humanas Las modificaciones posteriores, como las modificaciones de glicosilación postraduccional, las modificaciones de sialilación, etc., producen proteínas que son más similares a las proteínas biológicas naturales del cuerpo humano que otros sistemas de expresión. En cuarto lugar, una menor secreción de proteínas endógenas reduce la dificultad de purificación. ;

4. Se ha desarrollado una variedad de sistemas comerciales de alta eficiencia y alta expresión para células CHO, como el sistema de detección de dihidrofolato reductasa, el sistema de detección de glutamina sintetasa y el sistema de detección de genética.

Características heterogéneas de las células CHO

Los problemas de estabilidad y expresión de las células CHO durante el paso a largo plazo se reflejan principalmente en:

1. Inestabilidad de expresión de las células CHO causado por inestabilidad genética

El genoma de la línea celular CHO en sí es inherentemente inestable. Normalmente, los cromosomas de las células somáticas del hámster chino son 11 pares de 22, mientras que los cromosomas de las células de ovario del hámster chino han sufrido un reordenamiento y recombinación inestables a gran escala, y el número de cromosomas en diferentes líneas celulares no es constante. La inestabilidad del genoma se manifiesta principalmente en la variación del número de copias a nivel cromosómico.

2. Inestabilidad de expresión causada por la integración aleatoria de genes extraños

El método tradicional consiste en obtener líneas celulares que expresan proteínas diana mediante cribado por presión después de la transfección con plásmidos de expresión. Por lo tanto, los genes extraños se integran en el genoma de CHO mediante integración aleatoria. Debido a la incertidumbre del sitio de integración, puede producirse inestabilidad de la expresión en las últimas etapas del cultivo celular.

Las células del ovario del hámster chino tienen 22 cromosomas, incluidos 10 pares de autosomas y 2 cromosomas sexuales. La línea celular CHO-K1 muestra grandes diferencias. Sólo 8 de sus cromosomas son idénticos a los de los hámsteres chinos comunes, mientras que 13 cromosomas están marcados con "Z" porque contienen reordenamientos cromosómicos, deleciones, desplazamientos, etc.

1. Proceso de expresión de proteínas en las células

Representación de los diferentes pasos involucrados en la construcción de un sistema eficiente para la expresión de proteínas

3. Ingeniería de expresión de proteínas recombinantes Construcción de líneas celulares diagrama de flujo

¿Construcción de vectores?→?¿Transfección?→?¿Detección de grupo celular (pool)?→?¿Detección de monoclonalización?→?¿Detección de cultivos alimentados por lotes?→?Detección de calidad de proteínas?→?Selección de línea celular final y ¿Construcción de bibliotecas? →? Desarrollo y producción del proceso de cultivo celular

(1) Construcción de vectores de expresión de anticuerpos recombinantes: modificación de elementos vectoriales, optimización de codones, optimización de péptidos señal, etc.

( 2) Factores que afectan la transfección celular: eficiencia de la transfección y actividad celular

(3) Detección monoclonal: método de dilución limitante, ClonePix, FACS

Haixing utiliza el medio de cultivo ClonePlusTM para probar una variedad de líneas celulares, líneas celulares tumorales, líneas celulares primarias, líneas de células madre, etc., que pueden aumentar la eficiencia de formación de colonias entre un 20 y un 150% (los datos provienen de la comparación de la misma línea celular).

1. Optimización del diseño del vector

El diseño del vector de expresión debe adaptarse al sistema de expresión para aumentar la expresión de anticuerpos, aumentar la estabilidad celular y mejorar la eficiencia de la transcripción, secreción y selección. y la integración.

(1) Diversas formas de vectores de expresión

Vectores monocistrónicos, vectores de expresión multipromotor y vectores policistrónicos mediados por elementos IRES o Furin-2A, etc.

(2) Selección de elementos del vector de expresión

Promotores y potenciadores: promotor CMV, promotor SV40, promotor EF-1α, promotor CAG, etc.

PolyA : BGH PolyA, SV40 PolyA, etc.

Marcadores de detección: marcadores de detección metabólica MTX/MSX, marcadores de detección de antibióticos, etc.

(3) Efecto de posición y optimización del sitio de integración

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Elementos abiertos de cromatina, región de andamio/región de unión a matriz (S/MAR), sistema FRT/FLP, sistema Cre-loxp

Ventajas del sistema de introducción de genes VIRUS-Free:

·? Integración estable con alta eficiencia

·? Tamaño de inserción ilimitado

·? Fenotipo estable

2.

Utilice el sistema de recombinasa para la integración específica del sitio genético:

Primero, debe construir células plataforma y utilizar proteínas patrón (como GFP, etc.) para detectar niveles altos. sitios de expresión en el genoma de la célula huésped. La especificidad de la recombinasa se utiliza para lograr la integración específica del sitio del gen diana en el sitio.

Sistemas de recombinasa como la recombinasa Flp/FRT, la recombinasa Cre/loxp, la recombinasa PhiC31, la recombinasa Bxb1 y otros sistemas de recombinasa

3. Domesticación y transformación de líneas celulares diseñadas

Regula hacia arriba o hacia abajo la expresión de genes reguladores clave de las células huésped

Apunta a los genes reguladores clave de las células CHO y genera sublíneas de células CHO mediante ingeniería genética para transformarlas y domesticarlas para mostrar mejor resistencia a la apoptosis, metabolismo, glicosilación, expresión de proteínas, regulación del ciclo celular, proliferación, secreción o dinámica citoesquelética.

4. Solucionar problemas y optimizar a partir de problemas reales de construcción de líneas celulares

Para un anticuerpo cuyo nivel de expresión es inferior al esperado, puede seleccionar un anticuerpo de referencia con un nivel de expresión normal para control y estudio. :

(1) Explorar los efectos heterogéneos de los sitios de integración

(2) Explorar si los productos de expresión tienen un impacto en las células

(3) Explorar la transcripción genética niveles ¿Es normal?

(4) Explore la secreción de la proteína objetivo

(5) Explore el plegamiento y ensamblaje de la proteína objetivo