¿Cómo controlar la temperatura de recocido y la temperatura de extensión de la PCR?

1. La temperatura de recocido es aproximadamente 5°C menor que el valor de Tm del cebador, generalmente entre 45 y 55°C.

La temperatura de recocido debe determinarse desde muchos aspectos. Generalmente, se basa en el valor de Tm del cebador (valor de Tm = 4(G+C) +2(A+T)) como un. referencia, y se reduce apropiadamente según la longitud de la amplificación como temperatura de recocido. Luego haz una estimación basada en este experimento. La temperatura de recocido tiene un gran impacto en la especificidad de la PCR.

2. Tiempo de extensión: 1min/kb (dentro de 10kb).

La extensión del primer se realiza generalmente a 72°C (la temperatura óptima para la enzima Taq). Sin embargo, cuando la longitud de amplificación es corta y la temperatura de hibridación es alta, este paso se puede omitir. El tiempo de extensión depende de la longitud del fragmento amplificado. Generalmente se recomienda que sea superior a 1000 pb. , el tiempo de extensión se establece en 1 min/kbp.

Información ampliada

Proceso de PCR:

1. Desnaturalización del ADN: (90 ℃ -96 ℃): la plantilla de ADN bicatenario se hidrogena bajo la acción. de calor El enlace se rompe para formar ADN monocatenario.

2. Recocido: (60 ℃ -65 ℃): la temperatura del sistema disminuye y el cebador se combina con la plantilla de ADN para formar una doble cadena parcial. .

3. Extensión: (70 ℃ -75 ℃): bajo la acción de la enzima Taq (mejor actividad alrededor de 72 ℃), utilizando dNTP como materia prima, comience desde el extremo 3 ′ del cebador y extremo de Extender en la dirección 5′→3′ para sintetizar una cadena de ADN complementaria a la plantilla.

Enciclopedia Baidu—PCR