¿Qué software hay disponible para el diseño de cebadores? ¿Cuáles son las ventajas y desventajas?
¡Software relacionado con el diseño de Primer!
NoePrimer 2.03 Software único de diseño de cebadores
Primer Premier 6.0 DEMO análisis de secuencia y diseño de cebadores, un gran software.
Oligo 7.36 Demo es un software bien conocido para el diseño y análisis de cebadores. Se utiliza principalmente en software de diseño y análisis de cebadores de secuencias de ácidos nucleicos.
Primer D'Signer 1.1 es un software asistente de diseño de cebadores gratuito que se utiliza especialmente para los vectores de expresión pASK-IBA y pPR-IBA para simplificar el trabajo de diseño de cebadores.
Array Designer 4.25 Demo Software de microarrays de ADN (microarrays), una herramienta para el diseño por lotes de cebadores de ADN y oligonucleótidos.
Beacon Designer 7.80 Demostración Baliza molecular de PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real (Molecular beacon) y software de diseño de sondas TaqMan.
NetPrimer es un software de diseño de imprimaciones gratuito escrito en lenguaje JAVA. Se puede abrir y ejecutar con IE.
Software TGGE-STAR DOS, software de diseño de cebadores para PCR combinado con experimentos de electroforesis en gel en gradiente.
e-PCR 2.3.9 La clonación electrónica es un software informático que se utiliza para identificar sitios de etiquetas de secuencia de ADN (STS).
FastPCR 6.0.165b2 diseña rápidamente varios tipos de cebadores de PCR y también incluye algunas herramientas de software de secuenciación de proteínas y ADN de uso común.
Software de gestión de oligonucleótidos multiusuario OligoMaster 1.0.164, puede crear una base de datos de oligonucleótidos
PerlPrimer v1.1.19 es un software gratuito de código abierto que se utiliza para diseñar cebadores.
AmplifX 1.5.4 Software para el diseño y gestión de cebadores.
Software AutoDimer 1.0 para la detección rápida de cebadores dímeros.
MutaPrimer 1.00 Software de herramienta de escritorio de diseño de cebadores para mutagénesis dirigida a sitio
ORFprimer 1.6.4.1 Software de diseño de cebadores diseñado en lenguaje JAVA
Primer Prim'er 5.6. 0 Software de diseño de cebadores de PCR producido por Flash.
Software PCR Analyzer 1.0 para estimar la concentración inicial de amplicones en reacciones de RT-PCR en tiempo real
Herramienta online
DNAWorks 3.0 es un oligo de diseño para ayudar en la investigación genética Síntesis. Programas libres para secuencias de nucleótidos. El programa sólo requiere la entrada de información simple, como la secuencia de aminoácidos de la proteína objetivo y la temperatura a la que se sintetiza la secuencia de ácido nucleico. El resultado del programa es una secuencia de ácido nucleico con codones optimizados adecuados para la expresión en el organismo seleccionado. Con la ayuda de DNAWorks, se puede sintetizar con éxito un gen con una longitud de 3.000 pares de bases mediante un método de PCR de dos pasos. Sitio web original.
Primer Generator es un programa de diseño de imprimaciones en línea.
Primer 3 es un conocido programa de diseño de imprimaciones online.
Software de la serie java de diseño de cebadores de PCR en línea Primo Pro 3.4.
Web Primer es un software de diseño de cartillas en línea proporcionado por la Universidad de Stanford.
AutoPrime es un software en línea para diseñar rápidamente cebadores de PCR cuantitativos en tiempo real de expresión eucariota.
La búsqueda automática general de cebadores puede utilizar el software "Premier Primer 5" y el análisis de evaluación de cebadores puede utilizar Software "Oligo 6".
¡Adjuntas están las instrucciones para usar los dos softwares!
Introducción a las habilidades de uso de Primer Premier 5.0
1 Funciones
Las funciones principales de "Premier" se dividen en cuatro partes, entre las cuales tres funciones. se utilizan más comúnmente, a saber, diseño de cebadores (), análisis del sitio de endonucleasa de restricción () y búsqueda de motivos de ADN (). “Premier” también tiene una función de análisis de homología ( ), pero no es su especialidad y la omitiremos aquí. Además, el software tiene algunas funciones especiales, la más importante de las cuales es el diseño de cebadores degenerados, así como la "lectura" de secuencias, el intercambio de secuencias de ADN y proteínas ( ), la entrada de voz mediante el teclado ( ), etc.
En ocasiones es necesario diseñar cebadores basados en una secuencia de aminoácidos que se deduce del ADN. Dado que la mayoría de los aminoácidos (18 de los 20 aminoácidos estructurales comunes) tienen más de un código genético, es necesario. para deducir la secuencia de aminoácidos del mismo. Al secuenciar el ADN, encontrará incertidumbre en algunas bases. Los cebadores diseñados y sintetizados de esta manera son en realidad una mezcla de múltiples secuencias. La mayoría de sus composiciones de secuencias son las mismas, pero hay cambios en algunos sitios, que se denominan cebadores degenerados. Las reglas del código genético varían entre especies o subestructuras celulares. Por ejemplo, el código genético en las mitocondrias es diferente al del núcleo. "Premier" convierte secuencias de ADN y aminoácidos de acuerdo con las reglas del código genético correspondientes a la fuente del ADN molde. El software*** proporciona ocho reglas de código genético diferentes para subestructuras biológicas para que los usuarios elijan, incluyendo macronucleares ciliados, mitocondrias de invertebrados, micoplasmas y mitocondrias de plantas, mitocondrias de protozoos, mitocondrias estándar, de vertebrados y mitocondrias de levaduras.
2. Pasos y técnicas de uso
La interfaz de inicio del software "Premier" es la siguiente:
(No hay imagen al reimprimir)
Sus funciones principales son claras de un vistazo en la interfaz principal (las funciones de los botones son las anteriores). El análisis del punto de corte de la enzima de restricción y las funciones de búsqueda de motivos son relativamente simples. Después de hacer clic en el botón de función, seleccione la enzima o motivo de restricción correspondiente (como la secuencia -10, la secuencia -35, etc.) y haga clic en Aceptar. Generalmente se pueden encontrar enzimas de restricción y motivos comunes. También puede editar o agregar nuevas enzimas o motivos de restricción.
Al diseñar cebadores, haga clic en el botón y la interfaz será la siguiente:
Haga clic más en el botón y aparecerá la ventana "criterios de búsqueda", con varios parámetros que se pueden equilibrado. Hay tres opciones para fines de búsqueda (Buscar), cebadores de PCR, cebadores de secuenciación y sondas de hibridación. El tipo de búsqueda (Search Type) puede elegir buscar cebadores ascendentes y descendentes (Sense/Anti-sense Primer, o Ambos) por separado o simultáneamente, o buscar en pares (Pairs), o principalmente adecuados para cebadores ascendentes y descendentes (Compatible con Sentido). / Imprimación antisentido). Además, también puede cambiar el área de selección (Rangos de búsqueda), la longitud del cebador (Longitud del cebador), el modo de selección (Modo de búsqueda), la selección de parámetros (Parámetros de búsqueda), etc. Los usuarios pueden configurar varios parámetros según sus propias necesidades. Si no hay requisitos especiales, se recomienda utilizar la configuración predeterminada.
Luego
presione y la ventana Progreso de la búsqueda que aparece mostrará Búsqueda completada. Presione nuevamente. En este momento, los resultados de la búsqueda aparecen en forma de tabla. Hay tres métodos de visualización: imprimación ascendente (Sense) y. cebador aguas abajo (antisentido), mostrado en pares (pares). De forma predeterminada, se muestran en pares y se organizan en orden de mérito (calificación. La puntuación total es 100, lo que significa que todos los indicadores básicamente pueden cumplir con los estándares (como se muestra a continuación).
Haga clic en uno de los pares de cebadores, como el cebador n.º 1, y mueva o salga de la ventana anterior para mostrar la ventana principal de "Peimer Premier", como se muestra en la figura:
Esta figura está dividida en tres partes: la parte superior es un diagrama que muestra la plantilla de PCR y la posición del producto, en el medio se muestran algunas propiedades de los cebadores ascendentes y descendentes seleccionados, y la parte inferior es el análisis de cuatro indicadores importantes, incluida la estructura en horquilla (Hairpin). ), dímero (Dimer) ), cebado falso (False Priming) y formación de dímero entre cebadores ascendentes y descendentes (Cross Dimer). Cuando el cebador que se está analizando tiene la posibilidad de formar estas cuatro estructuras, el botón cambia a Haga clic en este botón y el estado de formación de la estructura aparecerá en la ventana de la esquina inferior izquierda. Un par ideal de cebadores no debería tener ninguna de las estructuras anteriores, por lo que el mejor de los casos es que no haya nada en la columna de análisis inferior, solo . Vale la pena señalar que la temperatura de recocido óptima del cebador se proporciona al final de la columna del medio, que puede usarse como referencia.
Cuando necesite modificar y editar el cebador, como agregar un sitio de restricción en el extremo 5', puede hacer clic y luego modificar la secuencia del cebador. Para volver a los resultados de la búsqueda, haga clic en el botón. Si desea diseñar un cebador degenerado, solo necesita seleccionar las ocho reglas del código genético mencionadas anteriormente en función del origen de la especie de la secuencia de aminoácidos fuente y conectarla a la secuencia de ADN. El análisis de los cebadores degenerados no necesita ser tan estricto como el de los cebadores generales. En resumen, "Premier" tiene una excelente función de búsqueda automática de cebadores, también puede analizar algunos indicadores y es fácil de usar. Es un software muy bueno.
Introducción a las técnicas de uso de Oligo 6.22
1. Función
Entre el software de diseño de imprimaciones especializado, “Oligo” es el más famoso. No es muy complicado de utilizar, pero los principiantes pueden dejarse intimidar fácilmente por sus complejos diagramas. La interfaz inicial de Oligo 5.0 tiene dos gráficos: gráfico Tm y gráfico ΔG; la interfaz de Oligo 6.22 es más compleja, con tres gráficos que aparecen y un gráfico Frq agregado. "Oligo" tiene una única función que "Premier", que es el diseño de cebadores. Pero su función de análisis de cebadores es tan poderosa que ha conquistado al mundo.
2. Uso (tomando Oligo 6.22 como ejemplo)
La interfaz de inicio de Oligo 6.22 es la siguiente:
Los tres indicadores que se muestran en la figura son Tm y ΔG respectivamente y Frq, donde Frq es una nueva función en la versión 6.22, que es la frecuencia de aparición de subunidades compuestas de 6 a 7 bases adyacentes en un archivo de base de datos específico. Una frecuencia alta aumenta la probabilidad de errores. Debido a que el análisis involucra múltiples indicadores, la disposición en cascada de la ventana de inicio no es conveniente. Puede cambiarla desde el menú de Windows al modo tili. Si cree que está demasiado lleno, puede eliminar un indicador, como Frq, para que la estructura de la interfaz sea la misma que Oligo5.0, pero la visualización sea más clara.
La visualización después de pasar el elemento Windows/Tili es como se muestra en la figura:
Al diseñar, puede seleccionar una secuencia basada en la información de los tres indicadores en el gráfico. Si lo considera apropiado, puede hacer clic en el mosaico Tm. Haga clic en el botón Superior en la esquina inferior izquierda para seleccionar el cebador ascendente. En este momento, el botón cambia para indicar que se ha seleccionado el cebador ascendente. Los pasos para seleccionar cebadores posteriores son básicamente los mismos que los anteriores, excepto que el botón cambia a Inferior. El valor de ?G refleja la fuerza de unión entre la secuencia y la plantilla. El valor de ?G del mejor cebador es relativamente alto en el extremo 5' y en el valor medio, mientras que es relativamente bajo en el extremo 3' (imagen:)
Valor Tm Es mejor elegir una curva cercana a 72 °C. La forma descendente de 5' a 3' también favorece la reacción de polimerización iniciada por el cebador. La curva Frq es un indicador recientemente introducido en "Oligo 6", que revela la probabilidad de repetición de fragmentos de secuencia. Al seleccionar cebadores, es aconsejable elegir un fragmento con un valor Frq relativamente bajo en el extremo 3'.
Después de seleccionar todos los cebadores ascendentes y descendentes, los cebadores deben evaluarse y modificarse en función de la evaluación. Primero verifique la posibilidad de formación de dímero de cebador, especialmente el dímero del extremo 3'. Cabe señalar que los dímeros de cebador pueden formarse mediante los propios cebadores aguas arriba o aguas abajo, o pueden formarse entre los cebadores aguas arriba y aguas abajo (dímero cruzado). Cuanto mayor es el valor energético de la formación de dímeros, menos cumple los requisitos. La PCR de detección general (sin clonación) tiene requisitos bajos en cuanto a la posición del cebador y el tamaño del producto, por lo que se deben seleccionar en la medida de lo posible cebadores que no formen dímeros o tengan valores de energía bajos. La segunda comprobación es para las horquillas; al igual que con los dímeros, cuanto menor sea el valor energético de las horquillas, mejor. En términos generales, el valor energético de estas dos estructuras no debe exceder 4,5.
Por supuesto, al diseñar cebadores de PCR con fines de clonación, los sitios de corte de enzimas generalmente se agregan a ambos extremos de los cebadores. Debe tener una estructura en horquilla y el valor energético no será demasiado bajo. Este tipo de PCR necesita ajustar de manera flexible la temperatura de recocido para lograr los mejores resultados, y la detección de la estructura en horquilla del cebador no debería ser demasiado exigente. La tercera comprobación es el contenido de GC, que es preferentemente del 45 al 55 %. Algunas plantillas tienen un contenido de GC alto o bajo, lo que hace que el contenido de GC de los cebadores no se controle dentro del rango anterior. En este caso, el contenido de GC y el valor de Tm de los cebadores aguas arriba y aguas abajo deben mantenerse cerca para facilitar la selección del recocido. temperatura. . Si la plantilla de PCR no es ADN genómico, sino una secuencia de plantilla específica, es mejor realizar también una prueba de sitio de cebado falso. Esta comprobación
puede revelar la posibilidad de que un cebador inicie una reacción de PCR en un sitio distinto del sitio objetivo. Si la eficacia de cebado del cebador en el sitio no coincidente es relativamente alta, pueden producirse resultados de PCR falsos positivos. Generalmente, la eficiencia de cebado no debe exceder 100, pero para una secuencia de plantilla específica, también se debe comparar la eficiencia de cebado en el sitio correcto. Si hay una gran diferencia entre los dos, por ejemplo, la eficiencia de cebado en el sitio correcto es superior a 450 y la eficiencia de cebado en el sitio incorrecto es 130, entonces este par de cebadores también es aceptable. Cuando terminemos las cuatro pruebas anteriores, presione la tecla Alt+P para que aparezca la ventana de PCR, que resume la ubicación del cebador, el tamaño del producto, el valor de Tm y otros parámetros. Lo más útil es que también proporciona el óptimo recomendado. Temperatura de recocido y evaluación sencilla.
Dado que la función de búsqueda automática de cebadores del software “Oligo” es similar a la de “Primer Premier 5” y no parece ser mejor que este último, no se describirá en detalle aquí. De hecho, el uso de software para buscar cebadores automáticamente permite a la computadora encontrar los mejores cebadores según los requisitos humanos. Si los parámetros se configuran adecuadamente, la eficiencia del trabajo mejorará enormemente.
Además del software de diseño de cebadores local, ahora existen algunos programas de diseño de cebadores en línea, como "Primer 3" desarrollado por el Instituto Whitehead (este sitio web http://210.72.11.60/ se ha introducido y depurado). Buen software, bienvenido a usarlo). La singularidad de este software radica en el diseño de cebadores para la PCR de todo el genoma; los cebadores diseñados se pueden comparar con la base de datos de ácidos nucleicos para descubrir y excluir cebadores que pueden causar discrepancias. Por lo tanto, se recomienda que lo prueben los usuarios que realizan con frecuencia PCR de genoma completo.