Pasos de extracción de plásmido
Los pasos para extraer el plásmido son los siguientes:
1. Pasos
1. Colocar 1% de células de E. coli que contengan plásmido en 2 ml de medio LB.
2. Incubar durante la noche a 37°C con agitación.
3. Tomar 1,5ml de células bacterianas en un tubo Ep (tubo de centrífuga), centrifugar a 4000rpm durante 3 minutos y desechar el sobrenadante.
4. Agregue 0,1 ml de solución I (1% de glucosa, 50 mM/LEDTApH8.0, 25 mM/LTris-HClPH8.0) y mezcle bien.
5. Añadir 0,2 ml de solución II (0,2 mM/LNaOH, 1 % SDS), girar suavemente, mezclar y colocar en un baño de hielo durante 5 minutos.
6. ml de solución pre-fría III (5mol/LKAc, pH 4,8), voltear suavemente para mezclar, colocar en baño de hielo durante 5 min.
7. Centrifugar a 10.000 rpm durante 20 min, tomar el sobrenadante en otro nuevo. Ep Tube
8. Agregar un volumen igual de isopropanol, mezclar y dejar reposar durante 10 minutos.
9. Centrifugar a 10.000 rpm durante 20 minutos y desechar el sobrenadante.
10. Lavar una vez con 0,5ml de etanol al 70% y escurrir todo el líquido.
11. Una vez seco el precipitado, disolverlo en tampón 50ulTE (o incubar en agua desionizada a 60°C).
2. Principio experimental
Existen muchos métodos para extraer ADN plasmídico según el rendimiento de la extracción, se puede dividir en microextracción, extracción media y extracción de grandes cantidades. El instrumento utilizado se puede dividir en extracción general y extracción con método de kit. Según el método de operación específico, se puede dividir en método de lisis alcalina, método de ebullición, método de palillo, etc. Cada método diferente tiene sus propias ventajas y desventajas. Se pueden utilizar métodos apropiados según diferentes propósitos experimentales. Consulte la "Guía de experimentos de clonación molecular".
3. Consejos de extracción
1. Después de agregar la Solución II (lisado), la operación debe ser suave. La mezcla vigorosa causará contaminación del ADN genómico.
2. La incubación a 60°C (Ellution-Buffer) con tampón de elución o agua desionizada es más efectiva durante la elución.
3. Si el contenido de extracción de plásmido es bajo, puede aumentar la muestra de líquido bacteriano o cambiar a ArtMedia-Plasmid-Culture, que tiene un mayor rendimiento de plásmido que el medio LB.
4. Las células bacterianas deben estar completamente suspendidas. Si no están completamente suspendidas, será difícil lisar completamente los grupos de células bacterianas restantes después de agregar la Solución II. Después de agregar este grupo a la Solución III, una parte de la proteína seguirá existiendo en la solución, convirtiéndose en la mayor fuente de residuos de proteínas.
5. Después de agregar la solución II, mezcle bien. Lo mejor es que el sistema se aclare inmediatamente. Si el sistema se vuelve transparente, agregue inmediatamente la Solución III para neutralizarlo.
6. Para la operación de neutralización, agregue la solución III al tubo de centrífuga de 1,5 ml, inviértalo dos veces para que el fondo del tubo quede hacia arriba, golpee el fondo del tubo varias veces con el dedo, y luego invertir para mezclar. El efecto es muy bueno.