Describir los principios básicos de la extracción de plásmidos mediante lisis alcalina y el papel de los reactivos clave.
Los principios básicos del método de lisis alcalina para la extracción de plásmidos y las funciones de los reactivos clave son los siguientes:
Exponer la suspensión bacteriana a un detergente aniónico fuerte con un valor de pH alto causará La pared celular al romperse desnaturaliza el ADN cromosómico y las proteínas, liberando ADN plasmídico al sobrenadante.
Aunque los disolventes alcalinos interrumpen por completo el emparejamiento de bases, las dobles hebras del ADN del plásmido de círculo cerrado no se separan entre sí porque están topológicamente entrelazadas entre sí. Siempre que la intensidad y duración del tratamiento alcalino no sean excesivas, las dobles hebras del ADN se volverán a formar cuando el pH vuelva a ser neutro.
Durante la lisis, las proteínas bacterianas, las paredes celulares rotas y el ADN cromosómico desnaturalizado se entrelazan entre sí formando grandes complejos, que se recubren con lauril sulfato. Cuando se utiliza K en lugar de Na, el complejo precipitará eficazmente de la solución. Después de eliminar el desnaturalizante mediante centrifugación, el ADN plasmídico renaturalizado se puede recuperar del sobrenadante.
La hidrólisis alcalina en presencia de SDS es una tecnología muy flexible que es aplicable a todas las cepas de E. coli y puede tener volúmenes de cultivo bacteriano que van desde 1 hasta más de 500 ml.
Más información es la siguiente:
En un ambiente alcalino de pH 12,0 ~ 12,6, el ADN cromosómico lineal de alto peso molecular de las bacterias se desnaturaliza y separa, mientras que el ADN cromosómico lineal de alto peso molecular de las bacterias se desnaturaliza y separa, mientras que el ADN cromosómico lineal de alto peso molecular se desnaturaliza y separa. El ADN plasmídico circular está desnaturalizado y separado. Desnaturalizado pero aún topológicamente entrelazado.
Cuando el pH se ajusta a neutro y en presencia de alta sal y baja temperatura, la mayor parte del ADN cromosómico, el ARN de gran peso molecular y las proteínas precipitarán bajo la acción del detergente SDS, mientras que el plásmido El ADN permanece en estado soluble.
Mediante la centrifugación, se pueden eliminar la mayor parte de los restos celulares, el ADN cromosómico, el ARN y las proteínas. El ADN plasmídico aún se encuentra en el sobrenadante. Luego se extrae el ADN plasmídico con fenol y cloroformo para purificar aún más el plásmido. ADN.
La lisis alcalina se utiliza comúnmente para extraer ADN plasmídico. Es el método más utilizado para preparar ADN plasmídico. Su principio básico es: en condiciones alcalinas (pH 12,5), el ADN cromosómico lineal tiene una estructura de doble hélice. se desenreda y desnaturaliza Aunque los enlaces de hidrógeno del ADN plasmídico se rompen, las dos hebras complementarias se entrelazan entre sí y se combinan estrechamente.