Principio de la PCR cuantitativa de fluorescencia

Principio de la PCR cuantitativa de fluorescencia:

A medida que avanza la reacción de PCR, los productos de la reacción de PCR continúan acumulándose y la intensidad de la señal de fluorescencia también aumenta proporcionalmente. Después de cada ciclo, se recopila una señal de intensidad de fluorescencia, de modo que podamos monitorear los cambios en la cantidad de producto a través de cambios en la intensidad de fluorescencia, obteniendo así una curva de amplificación de fluorescencia.

La PCR cuantitativa fluorescente primero se llamó TaqMan PCR, y más tarde también se llamó Real-Time PCR. Es una nueva tecnología cuantitativa de ácidos nucleicos desarrollada por la empresa estadounidense PE (Perkin Elmer) en 1995. Esta tecnología añade sondas marcadas con fluorescencia o tintes fluorescentes correspondientes a la PCR convencional para lograr su función cuantitativa.

En términos generales, la curva de amplificación de fluorescencia se puede dividir en tres etapas: la etapa de señal de fondo de fluorescencia y la fase de amplificación exponencial de la señal de fluorescencia. y fase de meseta. Durante la etapa de señal de fondo de fluorescencia, la señal de fluorescencia amplificada queda enmascarada por la señal de fondo de fluorescencia, lo que hace imposible determinar cambios en la cantidad de producto.

En la fase de meseta, el producto de amplificación ya no aumenta exponencialmente. No existe una relación lineal entre la cantidad final del producto de PCR y la cantidad de plantilla inicial, y no se puede calcular en función de la cantidad final del producto de PCR. Número inicial de copia de ADN.

Solo en la etapa de amplificación exponencial de la señal de fluorescencia, existe una relación lineal entre el valor logarítmico de la cantidad del producto de la PCR y la cantidad de plantilla inicial. Podemos optar por realizar un análisis cuantitativo en esta etapa. Para facilitar la cuantificación y la comparación, se introducen dos conceptos muy importantes en la tecnología de PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real: umbral de fluorescencia y valor de CT.

Umbral de fluorescencia (umbral)

es un valor establecido artificialmente en la curva de amplificación de fluorescencia. Se puede establecer en cualquier posición en la etapa de amplificación exponencial de la señal de fluorescencia, pero generalmente. la configuración predeterminada del umbral de fluorescencia es 10 veces la desviación estándar de la señal de fluorescencia en los primeros 3 a 15 ciclos de la reacción de PCR, que es el umbral.

Valor Ct: se refiere al número de ciclos experimentados cuando la señal de fluorescencia en cada tubo de reacción alcanza el valor umbral establecido.

La relación entre el valor Ct y la plantilla inicial:

Las investigaciones muestran que existe una relación lineal entre el valor Ct de cada plantilla y el logaritmo del número de copia inicial de la plantilla. La copia inicial Cuanto mayor sea el número, menor será el valor de Ct.

Se puede dibujar una curva estándar utilizando estándares con un número de copia inicial conocido, en la que la abscisa representa el logaritmo del número de copia inicial y la ordenada representa el valor Ct, como se muestra en la siguiente figura. Por lo tanto, siempre que se obtenga el valor Ct de una muestra desconocida, el número de copia inicial de la muestra se puede calcular a partir de la curva estándar.

Detección cuantitativa por fluorescencia

La detección cuantitativa por fluorescencia se puede dividir en sondas fluorescentes y colorantes fluorescentes según los marcadores utilizados. Las sondas fluorescentes incluyen la tecnología Beacon (tecnología de baliza molecular, representada por American Tagyi), las sondas TaqMan (representada por American ABI Company) y la tecnología FRET (representada por Roche), etc.;

Los tintes fluorescentes incluyen tintes fluorescentes saturados y tintes fluorescentes insaturados. El representante típico de los tintes fluorescentes insaturados son los tintes fluorescentes saturados SYBR Green I más utilizados, que incluyen EvaGreen, LC Green, etc.

Método del tinte fluorescente quimérico (SYBR Green I)

SYBR Green I es el tinte de unión al ADN más utilizado para la PCR cuantitativa de fluorescencia y se une de forma no específica al ADN bicatenario. En estado libre, SYBR Green I emite una fluorescencia débil, pero una vez combinado con ADN bicatenario, su fluorescencia aumenta 1000 veces. Por lo tanto, la señal de fluorescencia total emitida por una reacción es proporcional a la cantidad de ADN bicatenario que sale de la reacción y aumentará con el aumento del producto de amplificación.