Introducción a la tecnología de PCR cuantitativa
Contenido 1 Pinyin 2 Referencia en inglés 3 Concepto amplio 3.1 Clasificación 3.2 Modo de detección 4 Concepto específico 1 Pinyin
dìng liàng PCR jì shù 2 Referencia en inglés
Cadena de polimerasa Reacción
La tecnología de PCR cuantitativa (reacción en cadena de la polimerasa) tiene un concepto amplio y un concepto limitado. El concepto amplio de tecnología de PCR cuantitativa se refiere a la cuantificación de la cantidad de plantilla inicial de PCR mediante el análisis del producto de PCR final o el seguimiento del proceso de PCR, utilizando una referencia externa o una referencia interna como estándar. 3 Concepto amplio 3.1 Clasificación
La tecnología de PCR cuantitativa bajo el concepto amplio se puede dividir en cinco tipos:
(1) Método de referencia externa Análisis del producto final. El llamado "método de referencia externo" significa que la muestra y la referencia positiva se hacen reaccionar en dos recipientes de reacción. Este tipo no realiza monitoreo de control de calidad en las muestras y es propenso a resultados falsos negativos y falsos positivos. No monitorea la eficiencia de la amplificación y la cuantificación es inexacta.
(2) Método de referencia interna Análisis del producto final. El llamado "método de referencia interno" significa que la muestra y la referencia positiva se hacen reaccionar en un recipiente de reacción. Este tipo de control de calidad monitorea las muestras para eliminar resultados falsos negativos, pero la cuantificación es inexacta.
(3) Seguimiento del proceso por método estándar externo. Este tipo de seguimiento de la eficiencia de la amplificación permite una cuantificación precisa de las muestras positivas, pero no se pueden descartar resultados falsos negativos.
(4) Seguimiento del proceso mediante el método de referencia interna. Dado que la muestra y la referencia positiva reaccionan en el mismo recipiente, utilizando la misma enzima Taq y los mismos participantes de la reacción, existe una inhibición competitiva. Una reacción con una concentración de plantilla inicial alta inhibirá una reacción con una concentración de plantilla inicial baja, por lo que la cuantificación es necesaria. inexacto.
(5) Método estándar externo, seguimiento de procesos y control interno. Este tipo monitorea la eficiencia de la amplificación, cuantifica con precisión las muestras positivas y elimina los resultados falsos negativos. Este tipo debería promoverse. 3.2 Modo de detección
Existen muchos modos de detección para monitorear el proceso de PCR. Hay tres modos de detección más utilizados:
(1) Modo de detección R Verde I.
El ciclo de temperatura es un método de tres pasos de 94-55-72°C, solo con cebadores y sin sondas, y el tinte fluorescente se incrusta en el medio de la cadena de doble hélice. Las señales se obtienen mediante una fuerte detección de fluorescencia en una dirección específica. Este modo de detección de reactivos tiende a producir señales no específicas y tiene una gran luz de fondo.
(2) Modo Sonda de Hidrólisis (Taqman).
El ciclo de temperatura es un método de dos pasos de 94-60°C. No solo hay cebadores, sino también otra sonda específica para la plantilla amplificada entre los pares de cebadores. Se combinan dos tintes fluorescentes en dos grupos alquilo adyacentes de la sonda. Un tinte recibe la energía de la luz de excitación y la transfiere al segundo tinte que recibe la energía regresa a un estado estable emitiendo fotones característicos. Cuando la enzima Taq extiende la cadena de amplificación a 60°C, encuentra la sonda y utiliza la actividad exonucleasa 5`-3` de la enzima Taq para hidrolizar la sonda en un solo grupo alquilo. La distancia entre los grupos alquilo individuales es larga. , y el primero La energía del tinte no se puede transferir al segundo tinte, por lo que tiene que volver a un estado estable emitiendo fotones característicos y obtener una señal mediante la detección de fluorescencia del primer tinte en la solución. Este modo de detección de reactivo aumenta la especificidad de la señal de detección, pero debido a que utiliza la actividad exonucleasa 5`-3` de la enzima Taq, los fabricantes de reactivos generales solo calibran la actividad polimerasa de la enzima Taq y no calibran también el 5` de la enzima Taq. —3` Calibración de la actividad de la exonucleasa, diferentes lotes de reactivos traerán diferencias en la cuantificación. Además, solo se requiere que la temperatura del punto de fusión (Tm) de la sonda sea superior a 60 °C, lo que hace que la especificidad de los diferentes kits sea desigual y no pueda usarse para pruebas de control de calidad.
(3) Modo Sondas de Hibridación.
El ciclo de temperatura es un método de tres pasos de 94-55-72°C. Hay cebadores y dos sondas adyacentes que se dirigen específicamente a la plantilla de amplificación se encuentran entre los pares de cebadores y en la base 3' de uno. sonda Combine un tinte fluorescente y un segundo tinte fluorescente en la base 5' de la otra sonda. A 55°C, ambas sondas apenas se unen a la plantilla. La energía obtenida por el primer tinte que recibe la luz de excitación se transfiere al segundo tinte que recibe la energía vuelve al estado estable emitiendo fotones característicos. se obtiene mediante detección por fluorescencia del segundo tinte de la sonda dual unida a la plantilla de amplificación. En este modo de detección de reactivo, la señal de fluorescencia está relacionada con una temperatura de hibridación específica y la concentración de la sonda permanece constante. Por lo tanto, la curva de fusión se puede detectar después de la amplificación como control de calidad específico de la señal. Además, este modo de detección de reactivos se puede utilizar para la detección de mutaciones puntuales. 4 Concepto estrecho