¿Qué métodos de prueba se necesitan para detectar heparina sódica cruda?

Detección de heparina sódica bruta

Materiales y métodos

1. Extracción de ADN

1.1.Materiales necesarios:

Kit:

Kit de purificación de carne procesada ChargeSwitch? (N.° de producto CS400-100)

Kit de limpieza de ADN PowerClean (N.° de producto 12877-50)

Perlas para rumiantes y porcinos BioGX (n.º de producto 204-0002)

Requisitos del equipo:

Microcentrífuga

Bloque térmico

Agua libre de nucleasas

Vortex

Invitrogen Magna Rack

Tubos de 2,0 ml

Smart-Cycler

Smart Cycler centrífuga

Bloque de enfriamiento Smart Cycler

Tubos de reacción SmartCycler 25 ?L

1.2 Pasos de operación

Agregar la heparina mezclada. muestra de sodio hasta la línea de marca de 0,5 ml del tubo de centrífuga de 2 ml.

*Pasos clave: agregue solo una muestra a la vez y el siguiente tubo de centrífuga no se podrá abrir hasta que se agregue la muestra anterior.

b. Agregue 1 ml de tampón de lisis ChargeSwitch a la muestra. Al agregar tampón de lisis al tubo de centrífuga, incline el tubo ligeramente.

c. Agregue 100 μl de ChargeSwitch SDS a cada muestra. Vortex durante 5 segundos para mezclar.

d. Incubar a 95°C (baño maría o caja calefactora) durante 5 minutos.

e. Agregue 400 μl de tampón de precipitación ChargeSwitch (N5) a cada muestra. Vortex durante 5 segundos para mezclar.

f. Precipitar la proteína en el tubo de centrífuga en hielo durante 5 minutos.

g. Centrifugar a 16100g durante 5 minutos a temperatura ambiente.

h. Transferir 1200μl de sobrenadante a un tubo de centrífuga nuevo.

i. Agite con agitador el tubo de centrífuga que contiene las perlas magnéticas ChargeSwitch para resuspender completamente las perlas magnéticas empapadas en el tampón de almacenamiento.

j. Agregue 200 μl de detergente ChargeSwitch al tubo de centrífuga que contiene el sobrenadante.

k Agregue 40 μl de perlas magnéticas ChargeSwitch completamente resuspendidas.

l.mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo 5 veces.

m. Incubar a temperatura ambiente durante 1 minuto.

n. Coloque el tubo de centrífuga en el MagnaRack hasta que las perlas magnéticas ChargeSwitch formen un precipitado apretado y el sobrenadante se vuelva transparente (aproximadamente

1 min).

o.Dejar el tubo de centrífuga sobre el imán y absorber con cuidado el sobrenadante sin alterar el sedimento. Al aspirar el sobrenadante, no apunte la punta de la pipeta hacia el sedimento.

p. Retire el tubo de centrífuga del imán.

q.Agregue 1 ml de tampón de lavado ChargeSwitch al tubo de centrífuga, suba y baje 5 veces para mezclar.

r.Coloque el tubo de centrífuga en el MagnaRack hasta que las perlas magnéticas ChargeSwitch formen un precipitado apretado y el sobrenadante se vuelva transparente (aproximadamente

1 min).

Dejar el tubo de centrífuga sobre el imán y absorber con cuidado el sobrenadante sin alterar el sedimento. Al aspirar el sobrenadante, no apunte la punta de la pipeta hacia el sedimento.

t. Retire el tubo de centrífuga del imán.

u. Agregue 750 μl de tampón ChargeSwitchWash al tubo de centrífuga y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo 5 veces.

v. Coloque el tubo de centrífuga en el MagnaRack hasta que las perlas magnéticas ChargeSwitch formen un precipitado apretado y el sobrenadante se vuelva claro (aproximadamente

1 min).

w.Dejar el tubo de centrífuga sobre el imán y absorber con cuidado el sobrenadante sin alterar el sedimento. Al aspirar el sobrenadante, no apunte la punta de la pipeta hacia el sedimento.

x. Agregue 750 μl de tampón ChargeSwitchWash al tubo de centrífuga y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo 5 veces.

y Coloque el tubo de centrífuga en el MagnaRack hasta que las perlas magnéticas ChargeSwitch formen un precipitado apretado y el sobrenadante se vuelva transparente (aproximadamente

1 min).

z.Dejar el tubo de centrífuga sobre el imán y absorber con cuidado el sobrenadante sin alterar el sedimento. Al aspirar el sobrenadante, no apunte la punta de la pipeta hacia el sedimento. Para la última

limpieza, aspirar todo el sobrenadante.

aa. Retire el tubo de centrífuga del imán. No debe haber sobrenadante en el tubo en este momento.

bb. Agregue 75 μl de tampón ChargeSwitchElution (E5) al tubo de centrífuga.

cc. vierta suavemente hacia arriba y hacia abajo 10 veces para resuspender las cuentas magnéticas ChargeSwitch.

dd.

ee. Coloque el tubo de centrífuga en el MagnaRack hasta que las perlas magnéticas ChargeSwitch formen un precipitado apretado y el sobrenadante se vuelva transparente (aproximadamente

1 min).

ff.Dejar el tubo de centrífuga sobre el imán y transferir con cuidado el sobrenadante que contiene ADN a un nuevo tubo de centrífuga esterilizado de 2ml sin agitar

el sedimento. Al aspirar el sobrenadante, no apunte la punta de la pipeta hacia el sedimento.

gg. Deseche las cuentas magnéticas ChargeSwitch usadas.

*Congelar el ADN a -20°C o proceder a la purificación del ADN y eliminación de impurezas

2. Purificación del ADN y eliminación de impurezas

2.1. pasos

a. Agregue 75 μl de agua libre de nucleasas a la muestra de ADN.

b. Agregue 750 μl de solución 1 de PowerCleanDNA al ADN. Voltéelo de 3 a 5 veces para mezclar.

c. Agregue 20 μl de PowerCleanDNA Solution 2 y mezcle invirtiendo 3-5 veces.

Nota: Compruebe PowerClean DNA Solution 2. Si hay precipitado, colóquelo en un baño de agua a 60 °C y agite suavemente hasta que se disuelvan todos los precipitados. No agite vigorosamente para evitar la formación excesiva de espuma. Se puede utilizar en caliente.

d. Agregue 85 μl de PowerCleanDNA Solution 3 y mezcle invirtiendo de 3 a 5 veces. Incubar a 4°C durante 5 minutos.

e. Centrifugar a 10.000g durante 1 minuto a temperatura ambiente.

f. Evite la precipitación y transfiera todo el sobrenadante a un tubo de recolección de 2 ml limpio (provisto por el kit).

g. Añadir 70μl de PowerCleanDNA Solution 4 y mezclar invirtiendo 3-5 veces. Incubar a 4°C durante 5 minutos.

h. Centrifugar a 10000g durante 1 minuto a temperatura ambiente.

i. Evite la precipitación y transfiera el sobrenadante a un tubo de recolección limpio de 2 ml (proporcionado con el kit).

j. Agite bien la solución PowerCleanDNA 5. Agregue 800 μl de PowerCleanDNA Isolation 5 al sobrenadante, agite durante 5 segundos

y mezcle bien.

k Cargue 600 μl de sobrenadante en el filtro giratorio y centrifugue a 10000 g durante 1 minuto a temperatura ambiente.

l Desechar el filtrado, añadir los 600μl restantes de sobrenadante al Spin Filter y centrifugar a 10.000g durante 1 minuto a temperatura ambiente.

m. Desechar el filtrado. Agregue 500 μl de PowerCleanDNA Solution 6 al Spin Filer y centrifugue a 10 000 g durante 30 segundos a temperatura ambiente.

n.

o. Centrifugar a 13000g durante 2 minutos a temperatura ambiente.

p. Transfiera con cuidado el filtro giratorio a un nuevo tubo de recolección de 2 ml (incluido con el kit). Evite que se le aplique PowerClean DNA Isolation 6.

q.Agregue 75 μl de solución PowerCleanDNA 7 al centro de la membrana del filtro blanco.

Centrifugar a 10000g durante 30 segundos a temperatura ambiente.

Descartar el filtro de giro. Almacenar congelado a -20°C hasta la amplificación por PCR.

3. Amplificación por PCR cuantitativa por fluorescencia en tiempo real

Este flujo/paso de operación está diseñado para utilizar el SmartCycler de Cepheid para analizar la presencia de ADN de rumiantes en muestras de heparina porcina. El uso de este procedimiento en otras plataformas operativas requiere ajustes apropiados para verificar que esta parte cumpla con los procedimientos estándar (para la plataforma correspondiente).

3.1. Prepárese para la detección en tiempo real

a. Retire la bolsa sellada reutilizable que contiene el tubo de perlas de preparación de muestra del refrigerador. Rasgue la bolsa a través de la muesca en la parte superior del área sellada

.

b. Retire la cantidad requerida de tubos de la bolsa y abra suavemente cada tubo.

c.Añadir 25 ?L de agua libre de ácidos nucleicos (agua sin contaminación de ácidos nucleicos) a cada tubo, mezclar con una punta de pipeta y tapar el tubo.

d. Utilice una microcentrífuga para centrifugar rápidamente todos los tubos durante 5 segundos.

e.El control en blanco de perlas (perlas + agua sin ADN) debe analizarse al mismo tiempo que cada lote de muestras a analizar.

3.2.Pasos

a. Dispensar 25 µL de la mezcla maestra previamente preparada (perlas y agua) en el tubo de reacción de PCR SmartCycler.

b. Añadir 1 µL de muestra a cada tubo de reacción de PCR correspondiente.

c. Tapar el tubo y centrifugar en una centrífuga SmartCycler durante 5 segundos.

d.Coloque los tubos de reacción de PCR en cada pocillo del bloque SmartCycler y cierre cada tapa.

e. Prepárese para ejecutar el programa:

f. Haga clic en el icono "Crear Ejecutar". Seleccione FCTC para la configuración de tinte.

g. Seleccionar los procedimientos operativos (ver apartado 3.3).

h. Seleccione el número adecuado de sitios (es decir, el número de tubos de PCR en el experimento).

i. Etiquete cada sitio con una muestra correspondiente a los componentes de cada ID de tubo.

j. Haga clic en "Iniciar ejecución".

Nota: Los resultados positivos requieren un umbral de ciclo (valor Ct).

3.3 Condiciones de reacción de PCR

Este procedimiento operativo debe configurarse antes de iniciar la ejecución de PCR. Guarde los parámetros con nombres únicos.

Programa de PCR:

Primera etapa: 95.0°C 120s (elementos ópticos apagados)

Segunda etapa: 45 ciclos

95.0 °C 10 s (óptica apagada)

56,0 °C 60 s (óptica encendida)

Nota: durante el análisis, el valor Ct debe establecerse en el valor predeterminado de 30

4. Análisis de resultados

El tinte se configura en FCTC para la detección de fluorescencia. Se determinó un resultado positivo para ADN de rumiantes cuando una muestra mostró un valor de Ct antes de 45 ciclos de reacción en el canal FAM. El resultado positivo del material porcino es el valor Ct positivo en el canal TxR. El control de amplificación interna (IAC) se informa en el canal Cy5, lo que ayuda a reducir los informes de falsos negativos. Muchos tipos diferentes de muestras de heparina contienen inhibidores.

Este ensayo incluye un IAC para garantizar que las condiciones de la PCR sean apropiadas, minimizando así la notificación de resultados falsos negativos causados ​​por la inhibición de las enzimas de arranque en caliente. Específicamente, IAC puede reflejar resultados negativos informados cuando hay inhibidores de la PCR presentes en la muestra. Los cebadores y las sondas se unen a secuencias sintetizadas en la mezcla de reacción.

Cuando no hay inhibidores de la PCR en la muestra y la diana no está amplificada, el IAC debería producir una señal con un valor de Ct entre 32-37. Si la muestra objetivo está altamente concentrada, IAC puede informar o no amplificación debido a la competencia. Esto es normal.

Si el IAC aún no aparece con un valor Ct de 37, o no se informa (su valor Ct) en la amplificación de interés, la muestra puede contener un inhibidor de la PCR que impide la detección del propósito. Si se observa este resultado, se recomienda volver a extraer y purificar adicionalmente la nueva alícuota de heparina cruda antes de su uso.

Para resultados positivos en muestras de rumiantes, la misma muestra de ADN debe analizarse dos veces más mediante PCR. Es decir, si los tres resultados de la prueba son positivos, se confirma que la muestra es positiva.