¿Cuál es la diferencia entre inmunohistoquímica y Westernblot?

1. Principios diferentes:

La inmunohistoquímica utiliza la unión entre anticuerpos y antígenos para tener un alto grado de especificidad. Primero, se extrae una determinada sustancia química de los tejidos o células y se utiliza como antígeno o hapteno. Se obtienen anticuerpos específicos inmunizando animales y luego los anticuerpos se utilizan para detectar sustancias antigénicas similares en tejidos o células.

Westernblot también utiliza la unión entre anticuerpos y antígenos para tener una alta especificidad. La muestra de proteína separada mediante electroforesis en gel de poliacrilamida se transfiere a un portador de fase sólida. El portador de fase sólida adsorbe la proteína en forma de enlaces no valentes y puede mantener sin cambios el tipo de polipéptido separado por electroforesis y su actividad biológica. La proteína o polipéptido del vehículo en fase sólida se utiliza como antígeno, reacciona con el anticuerpo correspondiente y luego reacciona con la enzima o el segundo anticuerpo marcado con isótopos.

2. Localización tisular diferente:

La inmunohistoquímica es más precisa en la localización tisular y en aspectos cualitativos, pero no lo suficientemente precisa cuantitativamente. Westernblot es más preciso en la cuantificación porque tiene una calibración de referencia interna, pero no es tan bueno como la inmunohistoquímica en términos de localización de tejidos.

Información ampliada:

1. Pasos operativos de inmunohistoquímica (método SP):

1. Las secciones se desparafinan rutinariamente con agua. Si se requiere la recuperación del antígeno, se puede realizar después de este paso.

2. Lavar con solución tampón durante 3 minutos/2 veces.

3. Para reducir la tinción de fondo no específica causada por la peroxidasa endógena, incube las secciones en HydrogenPeroxideBlock durante 10-15 minutos.

4. Lavar con solución tampón durante 5 minutos/2 veces.

5. Agregue UltraVBlock gota a gota e incube a temperatura ambiente durante 5 minutos para bloquear la tinción de fondo no específica.

6. Lavar con solución tampón durante 5 minutos/2 veces.

7. Añadir gota a gota la solución de trabajo del anticuerpo primario e incubar a 37°C durante 1-2 horas.

8. Lavar con solución tampón durante 5 minutos/2 veces.

9. Añadir PrimaryAntibodyEnhancer (potenciador) gota a gota e incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos.

10. Lavar con solución tampón durante 5 minutos/2 veces.

11. Añadir gota a gota el polímero HRP (anticuerpo secundario marcado con enzima) e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.

12. Lavar con solución tampón durante 5 minutos/2 veces.

13. Añade 1-2 gotas de DABPlusChromogen (o AECPlusChromogen) a 1ml de DABPlusSubstrate (o AECPlusSubstrate), mezcla bien, añade gota a gota a las rodajas e incuba durante 3-15 minutos.

14. Enjuagar completamente con agua del grifo, contrateñir, deshidratar, aclarar y sellar.

2. Pasos de la operación Westernblot:

1. Reactivo SDS-PAGE: ver experimento de electroforesis.

2. Tampón de homogeneización: 1,0 MTris-HCl (pH 6,8) 1,0 ml; SDS al 10% 6,0 ml;

3. Tampón de transferencia: 2,9 g de glicina; 5,8 g de Tris; 0,37 g de SDS; agregar ddH2O para ajustar el volumen a 1000 ml.

4. 0,01 MPBS (pH 7,4): NaCl 8,0 g; KCl 0,2 g; Na2HPO 41,44 g; añadir ddH2O a 1000 ml.

5. Solución de tinción de membrana: 0,2 g de azul brillante de Coomassie; 80 ml de metanol; 2 ml de ácido acético; Solución de recubrimiento (5% de leche desnatada en polvo, recién preparada): 1,0 g de leche desnatada en polvo disuelta en 20 ml de 0,01 MPBS.

6. Solución cromogénica: DAB 6,0 mg; 0,01 MPBS 10,0 ml; sulfato de níquel amina 0,1 ml;