¿Qué significa masticar?
No sé si se trata de conexión de ADN, pero Chew-back es un método de ensamblaje de ADN.
La tecnología de recocido y empalme de una sola hebra, el llamado ensamblaje Chew-back, se refiere a la creación de áreas superpuestas entre moléculas de ADN y al empalme de moléculas mediante la idea de conexión o polimerización. Esta tecnología no solo omite el uso de enzimas de restricción y utiliza exonucleasas de ADN para generar extremos pegajosos más largos, sino que también utiliza un modelo de ensamblaje jerárquico para evitar la adición paso a paso, que requiere mucho tiempo y mano de obra, y la posibilidad de una sola vez; El ensamblaje correcto hace que sea más eficiente tanto en términos de número como de tamaño de los fragmentos de ADN ensamblados. Por ejemplo, las tecnologías de ensamblaje y SLIC de Gibson son actualmente las más utilizadas.
En 2008, al construir el genoma de Mycoplasma genitalium, Gibson et al utilizaron por primera vez su propio método de ensamblaje in vitro en dos pasos a temperatura variable para obtener un genoma de Mycoplasma de 1/4 de tamaño, y luego. mejoraron la tecnología para convertir este genoma en un genoma. Se ensamblaron in vitro cuatro fragmentos de más de 100 kb para formar un genoma completo de M. genitalium de 583 kb. En 2010, el grupo de investigación de Gibson ensambló artificialmente con éxito un genoma mitocondrial de ratón de 16,3 kb in vitro utilizando 600 oligonucleótidos de 60 pb con secuencias superpuestas de 20 pb en condiciones optimizadas.
Se puede ver que la tecnología de empalme de Gibson puede lograr fácil y rápidamente un ensamblaje perfecto de múltiples fragmentos de ADN, y la escala de ensamblaje es muy impresionante. El tamaño de molécula de ADN más grande que se ha ensamblado con éxito es 1,08.
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Mb. Sin embargo, a medida que aumenta el número de fragmentos de ADN ensamblados al mismo tiempo, su eficiencia y precisión también disminuirán, y las secuencias superpuestas requeridas también serán más largas y el costo de la síntesis de cebadores también aumentará en consecuencia.
SLIC es un método de clonación que no se basa en reacciones de secuenciación y ligación. Utiliza principalmente T4.
La ADN polimerasa realiza la extrusión de ácido nucleico 3′ → 5′ en ausencia de dNTP. La actividad de Dicer digiere fragmentos de ADN para producir extremos adhesivos 5' que contienen secuencias terminales superpuestas y luego se hibrida entre fragmentos de ADN o entre fragmentos de ADN y vectores basados en secuencias superpuestas (Rec
A puede mejorar la eficiencia de la recombinación), formando un intermedio circular y, finalmente, transformar directamente las células competentes de E. coli y utilizar el propio sistema de reparación de E. coli para repararlas en un plásmido recombinante circular completo
. En 2009, el grupo de investigación de Stephen Elledge en la Facultad de Medicina de Harvard en Estados Unidos utilizó SLIC para lograr el empalme en un solo paso de nueve fragmentos de ADN (275-980
pb) que contenían secuencias superpuestas terminales de 40 pb.
El método de empalme SLIC no requiere ligasa ni necesita considerar la secuencia del fragmento de ADN insertado en sí. Puede lograr el ensamblaje único de múltiples fragmentos de ADN y es una tecnología eficaz para la construcción. rutas biosintéticas. En la actualidad, muchas empresas extranjeras lo han comercializado. Por ejemplo, el sistema RadianceTM de Novagen y el sistema GatewayTM de Invitrogen se desarrollan basándose en esta tecnología. En comparación con la tecnología de ensamblaje de Gibson mencionada anteriormente, SLIC solo requiere una enzima (ADN polimerasa T4) para completar el ensamblaje de múltiples fragmentos, mientras que el ensamblaje de Gibson requiere ácido nucleico T5. efecto sinérgico de Dicer, ADN polimerasa y Taq ligasa. Sin embargo, esta tecnología sólo puede ensamblar fragmentos de ADN de tamaño mediano, mientras que el ensamblaje de Gibson puede ensamblar fragmentos de ADN grandes de hasta 580 kb.
Además, In-FusionTM Cloning también es una tecnología de ensamblaje similar a SLIC que no depende de reacciones de ligación. La diferencia es que In-FusionTM
Cloning utiliza una tecnología de ensamblaje con. funciones similares. Gibson cuenta actualmente con kits de prueba comerciales.
Los detalles se pueden encontrar en la URL:
/html/wswxtbcn/2015/11/tb15112229.htm