Cómo diseñar rápidamente shRNA

En el estudio de la función genética, el ARNi se ha convertido en una poderosa herramienta en experimentos biológicos porque puede silenciar o reducir específicamente la expresión genética. Entre ellos, los vectores lentivirales shRNA se utilizan ampliamente. Hoy les contaré dos métodos para diseñar y construir rápidamente shRNA en vectores lentivirales.

1. Sitio web de Sigma

Sigma ya ha creado bibliotecas de shRNA humanos y de ratón, y se han verificado las secuencias de shRNA de algunos genes, por lo que es más conveniente utilizar directamente las secuencias de RNAi. que Sigma ha verificado.

Primero abra el sitio web:/life-science/functional-genomics-and-RNAi/SiRNA/mission-predesigned-SiRNA.html, tomando Fli1 como ejemplo, ingrese el nombre del gen directamente y haga clic en buscar , la pantalla es la siguiente Interfaz:

Busque y haga clic en la opción shRNA en el producto, y aparecerá la siguiente interfaz:

Haga clic en el precio en "Misión shRNA Lentiviral Transformation Partículas" y una interfaz emergente mostrará el shRNA del gen objetivo:

Cuando aparezca, felicidades, este gen ha sido verificado por sigma. Puede encontrar el lentivirus construido con shRNA verificado visitando desplazarse hacia abajo es simple y efectivo, y la eficiencia de eliminación está básicamente garantizada. Si no hay shRNA validado, también puede seleccionar más shRNA según sea necesario para detectar objetivos efectivos. Consejo: el editor tiende a elegir shRNA en la región CDS, y básicamente no se selecciona 3UTR. Cada shRNA seleccionado se realizará BLAST en NCBI para garantizar la especificidad del objetivo. Después de la comparación de Blast, finalmente se confirmó que se seleccionaron los siguientes dos genes de shRNA de FLI1:

Es importante tener en cuenta que si se va a construir en un vector lentiviral, dependiendo del vector, el sintético Los cebadores de shRNA algo es diferente. sigma utiliza el vector pLKO.1 y los editores suelen utilizar el vector pGreenPuro (CMV) de SBI, siendo los sitios de restricción en ambos extremos BamHI/EcoRI. Los cebadores diseñados serán así (un shRNA diferente reemplaza la parte roja en el medio):

sentido:gatcccctcttctgacatcctacatctcgagagtaggagattgtcagaaggtttttttg

Antisentido: aattcaaaaaacccttctgacatcctacatctcgagagtaggagattgtcagaagggg

2. Sitio web

Life Technologies tiene un software de diseño de shRNA en línea muy práctico, que es muy conveniente de operar. El shRNA diseñado se puede usar directamente sin destruirlo en NCBI.

Primero abra el sitio web:/rnaiexpress/, seleccione shRNA en Opciones de diseño de destino, tome Fli1 como ejemplo, ingrese el número de acceso o la secuencia de nucleótidos, otras condiciones permanecen sin cambios:

Haga clic RNAi Design, aparecerán 10 secuencias objetivo recomendadas:

Según la clasificación de estrellas, elige lo que necesitas (generalmente 4 Cuihua, 1 en cada posición diferente), haz clic en la clasificación para diseñar shRNA Oligos:

Luego seleccione la secuencia apropiada de la secuencia de bucle predeterminada (el vector utilizado para Cuihua es pGreenPuro, que no tiene esta secuencia de forma predeterminada y se eliminará al sintetizar cebadores en el futuro), ingrese CTCGAG en el bucle personalizado secuencia y haga clic en Diseño:

Buscar shRNA

Recordatorio: los cebadores sintetizados deben ajustarse. De acuerdo con los requisitos del vector, al igual que el diseño de sigma, es necesario agregar sitios de restricción antes y después, y finalmente se completa.