Cómo comprobar el éxito de la extracción de ARN o cómo comprobar la integridad del ARN

Cuando se somete a electroforesis en gel desnaturalizante, el ARN total intacto producirá bandas claras de ARNr 28S y 18S (muestras eucariotas). La banda de ARNr 28S debería ser aproximadamente el doble de intensa que la banda de ARNr 18S. Esta proporción de 2:1 (28s: 18s) es un buen indicador de la integridad del ARN.

Una desventaja de utilizar electroforesis en gel desnaturalizante para evaluar la integridad del ARN es la necesidad de observar la cantidad de muestra de ARN. Normalmente, es necesario cargar al menos 200 ng de ARN en un gel desnaturalizante para visualizarlo con tinción con EtBr. En algunos experimentos de preparación de ARN, como la extracción de ARN de muestras de biopsia con aguja o muestras de microdisección por captura con láser, el rendimiento es muy bajo. En este caso, puede que no sea posible eliminar 200 ng de ARN para evaluar su integridad antes de realizar experimentos de perfiles de expresión. Otros tintes de ácido nucleico, como el tinte de ARN SYBR Gold y SYBR Green II, pueden aumentar significativamente la sensibilidad en comparación con los métodos tradicionales de tinción con EtBr para electroforesis en gel de agarosa. Al utilizar una fuente de luz transmitida de 300 nm (6 bombillas de 15 vatios) y filtros especiales, la tinción en gel SYBR Gold RNA puede detectar tan solo 1 ng de ARN, mientras que SYBR Green II puede detectar 2 ng, lo que permite procesar el ARN con menos muestra. análisis.

Ahora existe un método rápido y sencillo que puede reemplazar el análisis en gel tradicional y puede cuantificar y evaluar simultáneamente la calidad de las muestras de ARN. El bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies, Inc.) es el primer instrumento de microfluidos comercial que proporciona información detallada sobre el estado de las muestras de ARN. Cuando se utiliza con el chip de laboratorio RNA 6000 (marca registrada propiedad de Caliper Technologies Corporation), el tiempo mínimo de análisis es de solo 1 µl para muestras con una concentración de 10 ng/l, además de evaluar el ARN. Para garantizar la integridad, este sistema automatizado también puede proporcionar una evaluación de la concentración y pureza de la muestra de ARN (por ejemplo, contaminación de ARNr en la preparación de ARNm). En el pasado, algunas muestras de ARN eran necesarias para probar la concentración y la pureza (mediante espectrofotometría A260) y otras para evaluar la integridad. Al utilizar el chip de laboratorio, este sistema puede analizar simultáneamente la concentración, la integridad y la pureza utilizando solo una muestra de 5 ng. Los datos analíticos se pueden mostrar como imágenes de gel, picos de electroforesis y tablas.