Cómo dibujar correctamente el patrón de electroforesis de película de acetato de celulosa sérica
Diversas proteínas séricas contenidas en el cuerpo humano desempeñan muchas funciones especiales. La concentración total de proteínas séricas y la proporción de cada componente proteico pueden cambiar durante diversas enfermedades. Por lo tanto, la cuantificación de las proteínas séricas y de cada componente proteico es de gran valor en el diagnóstico y tratamiento clínico [1]. Por lo tanto, el experimento "Electroforesis de película fina de acetato de celulosa y proteína sérica" es uno de los proyectos experimentales básicos que se ofrecen con mayor frecuencia en el proyecto experimental de la asignatura "Bioquímica". El establecimiento de este experimento ayuda a los estudiantes a comprender mejor los componentes básicos y los contenidos normales de. proteínas séricas. Sin embargo, debido a la gran proporción de trabajo manual en el análisis de electroforesis, muchos factores como la experiencia y las técnicas de los técnicos, la temperatura y el tiempo de la electroforesis, los cambios en la ionicidad del tampón, la decoloración y la transparencia de la película de electroforesis afectan directamente la precisión y repetibilidad de los resultados del análisis [2]. Para que el experimento de electroforesis de película de acetato de celulosa y proteína sérica sea exitoso, debemos prestar atención a todos los aspectos del experimento, especialmente al equipo experimental, los medicamentos y vehículos experimentales, la preparación experimental, la operación del estudiante y otros aspectos importantes. Después de años de práctica repetida, el autor cree que se debe prestar atención a los siguientes cuatro vínculos principales para lograr el éxito en el experimento de "electroforesis de película fina de acetato de celulosa y proteína sérica".
1. Se debe prestar atención a los instrumentos experimentales:
1.1 Instrumento de electroforesis y tanque de electroforesis DYY-Ⅲ8A Instrumento de electroforesis con sincronización de flujo y voltaje estable y tanque de electroforesis producidos por Beijing Liuyi Instrument Factory . Al principio o al final de cada prueba, se debe prestar atención a ajustar cada cubo de ajuste del instrumento de electroforesis a la posición cero. El tanque de electroforesis debe lavarse con agua y luego enjuagarse y secarse con agua destilada para proteger el alambre de platino de la corrosión. .
1.2 Balanza analítica Balanza analítica TG328B producida por Shanghai Tianping Instrument Factory. Realice una depuración antes de su uso para garantizar resultados de medición correctos.
1.3 Espectrofotómetro Espectrofotómetro 721 fabricado por Shanghai No. 3 Analytical Instrument Factory. Realice una depuración antes de su uso para garantizar una cantidad de pesaje precisa.
2. Se debe prestar atención a los medicamentos y vehículos experimentales:
2.1 Los medicamentos experimentales se utilizan para preparar soluciones tampón y soluciones de tinción. Intente elegir medicamentos producidos por fabricantes habituales y grados de reactivos. Se requiere que sea AR o superior, y el barbitúrico y el barbitúrico de sodio necesarios para preparar la solución tampón deben ser producidos por el mismo fabricante en la medida de lo posible y prestar atención a la fecha de vencimiento.
2.2 Portador Debido a los diferentes componentes y mano de obra del portador, las diferentes capacidades para adsorber y separar las proteínas del suero causarán diferencias en los resultados de la electroforesis [3]. Por lo tanto, los requisitos de calidad de la película de acetato de celulosa (elegimos la película de acetato de celulosa producida por la fábrica de materiales bioquímicos Zhejiang Huangyan Siqing) como portador para la electroforesis de proteínas séricas deben ser de buena calidad, poros finos, fuerte absorción de agua, baja adsorción de colorante y separación de zonas de proteínas. Los que son brillantes y estables para la tinción de proteínas son mejores.
3. Se debe prestar atención al preparar la prueba:
3.1 Se preparan reactivos para preparar soluciones tampón (Tampón barbitúrico - Barbitúrico/Barbitúrico de sodio, PH8.6, Fuerza iónica 0.06 ) requiere pesar con una balanza analítica, preferiblemente con una precisión de 0,001 g. Si la fuerza iónica del tampón preparado es demasiado baja, fácilmente conducirá a la formación de relaves en las zonas; si la fuerza iónica del tampón es demasiado alta, fácilmente conducirá a una sobredensificación de las zonas. El medicamento para preparar la solución de teñido (negro amino 10B) también se pesa con una balanza analítica, preferiblemente con una precisión de 0,01 g. Se pueden preparar otros reactivos según la rutina.
3.2 Preparación del instrumento de electroforesis y tanque de electroforesis y conexión de electrodos
3.2.1 Preparación del instrumento de electroforesis Primero verifique el estado funcional del instrumento de electroforesis, ajuste cada cubo de ajuste. a la posición cero y reinicie el puntero.
3.2.2 Preparación del tanque de electroforesis. Primero, lave el tanque de electroforesis con agua, luego enjuague el tanque de electroforesis con agua destilada y séquelo. Coloque las cuatro capas de gasa seca lavadas y dobladas sobre el tampón. Remójelo en un tanque de vidrio con líquido, luego colóquelo en el soporte del tanque de electroforesis para puentearlo y luego agregue un volumen igual de solución tampón a los tanques de electroforesis en ambos lados hasta el nivel de la línea de escala.
3.2.3 Conexión de electrodos Para las dos primeras electroforesis, los electrodos del instrumento de electroforesis se pueden conectar a los electrodos del tanque de electroforesis de acuerdo con el "método de conexión normal". Si realiza la electroforesis varias veces seguidas, deberá "reemplazar el método de conexión del electrodo" para obtener el efecto de electroforesis ideal. De lo contrario, deberá reemplazar el tampón en el tanque de electroforesis.
4. Los estudiantes deben prestar atención al operar:
Guiar correctamente a los estudiantes para operar durante el experimento es una parte importante de la realización de este experimento. Es necesario fortalecer la supervisión de los estudiantes en. preparación, manchado, electroforesis, Las instrucciones para encender, teñir y enjuagar, y cuantificación se encuentran principalmente en el paso de "manchado".
4.1 Prepárese para cortar la película de acetato de celulosa en tiras rectangulares de 2 × 8 cm. Utilice un lápiz para dibujar ligeramente una línea horizontal a 1,5 cm de un extremo de la superficie rugosa como marca para la "posición de muestreo". Se puede numerar a cada estudiante según su número de estudiante y luego colocarlo en un tanque de vidrio lleno con solución tampón, remojarlo y agitarlo continuamente durante 5 a 10 minutos después de que la película esté completamente empapada, es decir, cuando no haya manchas blancas. la tira de película, use una cámara para sacarla y sujétela. Seque el exceso de tampón en medio de papel de filtro limpio. Tenga cuidado de no absorberlo demasiado seco para evitar afectar la conductividad. La película de manchado está demasiado seca, lo que produce rayas en el patrón de electroforesis. Además, no retenga demasiado tampón para evitar que el suero se esparza con el tampón durante el manchado.
4.2 Manchado Dominar la técnica del manchado es el paso más importante para obtener un patrón de electroforesis claro. Primero ponga una pequeña cantidad de suero en la placa de vidrio, sumerja la boca de acero del observador (hecha de cubierta de aluminio) en el suero y luego "imprima" el valor plano de la boca de acero en la línea de manchado (no use exceso fuerza para evitar romper la película), retire el quitamanchas después de que el suero penetre en la película. Preste atención a si el suero se distribuye uniformemente en la línea de manchado. Si hay difusión del suero o distribución desigual, deséchelo y use otra película de repuesto preparada (empapada) para manchar.
Debe tenerse en cuenta que la distribución desigual del suero durante el manchado puede conducir fácilmente a patrones de electroforesis desiguales; agregar demasiado suero durante el manchado puede conducir fácilmente a una separación deficiente o colores intermedios más claros en el patrón de electroforesis; El suero puede provocar una tinción demasiado clara del patrón de electroforesis. Estos factores afectarán el análisis de los resultados de la electroforesis de proteínas. Por lo tanto, se debe guiar a los estudiantes para que dominen la cantidad de muestra durante las operaciones experimentales para evitar errores resultantes en la determinación cuantitativa.
4.3 Durante la electroforesis, coloque el extremo de la película manchada cerca del cátodo, con la superficie rugosa (es decir, la superficie manchada) hacia abajo (para evitar que la evaporación y la sequedad afecten la conductividad) y planamente cerca de la "Puente Sab" del soporte del tanque de electroforesis superior. Cubra la tapa y espere 5 minutos antes de encender la alimentación. Tenga en cuenta que si el tanque de electroforesis no está bien cerrado, la película se evaporará fácilmente, lo que provocará rayas en el patrón de electroforesis.
4.4 Fuente de alimentación Generalmente, el voltaje es de 130~160V. Si se utiliza la corriente, la conversión se basa en 0,4~0,6 mA/cm
. Se tarda entre 40 y 50 minutos en encenderse en verano y unos 60 minutos en invierno. Cuando la zona de electroforesis se expanda unos 3,5 cm, ajuste el cubo de ajuste a la posición cero y luego corte el suministro de energía. Si se produce electroósmosis, se puede aumentar la cantidad de corriente para superarla. Sin embargo, una corriente excesiva puede provocar fácilmente rayas en el patrón de electroforesis.
4.5 Teñido y enjuague: Retire con cuidado la película del tanque de electroforesis, sumérjala directamente en el tanque de vidrio que contiene la solución de teñido y agítela suavemente continuamente durante 5 minutos cuando la zona de electroforesis azul pueda verse claramente. visto, sáquelo y enjuague continuamente con líquido de enjuague hasta que desaparezca el color de fondo de la película. Es decir, se obtienen cinco cintas proteicas. Desde el extremo alejado de la mancha, se encuentran la albúmina, α1, α2, β y γ globulina. Cabe señalar que un tiempo de tinción insuficiente puede hacer que el color intermedio de la albúmina se aclare fácilmente después de la tinción.
4.6 Seque cuantitativamente la membrana enjuagada con papel de filtro, corte las zonas proteicas en secciones y sumérjalas en tubos de ensayo que contengan una solución de 0,4 mol/LnaOH. Utilice 4 ml para el tubo de albúmina y 4 ml para el resto. tubos de 2ml. Agite varias veces y el color azul se lixiviará por completo durante unos 25 minutos. Utilice un espectrofotómetro 721 para realizar una comparación de colores a una longitud de onda de 580 a 620 nm, ajuste a cero con agua destilada, lea la absorbancia de cada tubo y calcule el porcentaje de albúmina y diversas globulinas.
4.7 Transparencia Si necesita conservar los resultados de la electroforesis, puede hacer que la película sea transparente de acuerdo con el siguiente método: Remoje el patrón de electroforesis de la película de acetato de celulosa después de teñirlo, enjuagarlo y secarlo (se puede secar en horno de secado) en una solución transparente durante 1 ~ Retírelo después de 3 minutos y péguelo en la placa de vidrio sin burbujas de aire. La película será completamente transparente en aproximadamente 2 a 3 minutos. Después del secado, quítela y presiónela. Puede almacenarse durante mucho tiempo y usarse directamente para escanear y analizar con un densitómetro.