Edición genética del ARN circulante | Pozo fuente
Con el desarrollo de la tecnología de secuenciación de alto rendimiento y la bioinformática, se han descubierto miles de circRNA y cada vez hay más estudios básicos sobre los circRNA. Una gran cantidad de estudios han demostrado que el circRNA es endógeno, abundante, conservado y estable en células de mamíferos y, a menudo, muestra especificidad tisular o espaciotemporal. Puede participar en la regulación del crecimiento y desarrollo corporal y en la aparición y desarrollo de enfermedades a través de diversos mecanismos. . Por lo tanto, el circRNA se ha convertido gradualmente en un punto caliente en el campo de la investigación del ARN no codificante en los últimos años.
Según la fuente de las secuencias de circRNA, se pueden dividir en tres categorías: 1. ¿Todas las secuencias provienen de exones, llamados circRNA exónicos? 2.? ¿Secuencias derivadas de exones e intrones, llamadas EIciRNA? 3. Estas secuencias se derivan de intrones y se denominan ARNci.
El CircRNA se forma mediante empalme hacia atrás de pre-ARNm. Actualmente, se han informado tres tipos principales de modelos de formación de anillos:
? Las secuencias complementarias inversas de los intrones impulsan la circularización
Los intrones flanqueantes en ambos extremos del exón contienen múltiples pares de secuencias complementarias inversas, que promueven el emparejamiento de secuencias de intrones y acercan el donante de empalme aguas abajo a los cuerpos aceptores de empalme aguas arriba, de esta manera combinándose para formar ARN circular. (Figura 1. Izquierda)
? Circularización impulsada por la proteína de unión a ARN
Los intrones flanqueantes en cada extremo del exón circularizado contienen motivos reconocidos por las proteínas de unión a ARN (RBP). Cuando las RBP se unen a motivos específicos en los intrones flanqueantes, se forman dímeros que impulsan los intrones flanqueantes entre sí y luego se unen para formar un bucle. (Figura 1. Derecha)
? Circularización impulsada por lazo
Se produce un evento de omisión de exón durante el empalme previo al ARNm, lo que produce un intermediario de lazo que contiene exones e intrones, que luego se empalma hacia atrás para formar un ARN circular. (Figura 2.)
La función más común del circRNA es actuar como una esponja para el miRNA y unirse a él, afectando así la regulación de los genes por parte del miRNA. Por ejemplo, Cdr1as, una molécula de ARN circular transcrita por la cadena antisentido, es un gen proteico relacionado con la degeneración cerebelosa y se ha estudiado ampliamente. Contiene alrededor de 70 sitios de unión para miR-7 y 1 sitio de unión para miR-671. El modo de unión con miR-7 no es completamente complementario, solo se une y no será degradado por la proteína AGO2. Cuando Cdr1as está altamente expresado, miR-7 se une y no puede inhibir el ARNm de los protooncogenes, lo que regula positivamente la expresión de los protooncogenes y conduce a la canceración. Cuando miR-671 se expresa altamente, Cdr1as se degrada y libera miARN, que se combina con el ARNm del protooncogén para ejercer una regulación negativa del gen e inhibir la aparición de cáncer. (Figura 3.)
Muchos ARN circulares contienen sitios de unión a proteínas y pueden usarse como esponjas de proteínas. Por ejemplo, el factor de corte de ARN Mbl puede unirse al segundo exón del gen parental y promover su ciclación para formar circ-Mbl. circ-Mbl puede combinarse con Mbl para reducir la concentración efectiva de MBL y reducir la producción de MBL.
Además de servir como miARN y esponja proteica, el circRNA también puede servir como proteína de andamio para promover la localización de enzimas, inhibir la expresión de genes diana mediante la unión a factores de transcripción y participar en la regulación de la expresión. de genes parentales, y también pueden traducirse en determinadas circunstancias. Dependiendo de las funciones involucradas, la localización celular del circRNA también es diferente. Por ejemplo, cuando se usa como miARN o esponja proteica, el ARNcirc debe transportarse desde el núcleo a la matriz celular para desempeñar un papel. Cuando participa en la regulación de la expresión de genes parentales o en la unión con factores de transcripción para inhibir genes diana. El circRNA a menudo funciona en el efecto del núcleo.
(Referencia: Christensen, L.S., Anderson, M.S., Stagsted, L.V., Eberson, K.K., Hansen, T.B., & Kjems, J. (2019). Biogénesis, biología y caracterización de ARN circulares. ? Naturaleza Reviews Genetics 20(11), 675-691.)
Cada vez se ha descubierto que los circRNA endógenos se expresan ampliamente en tejidos humanos, y la relación entre los circRNA y las enfermedades se ha convertido gradualmente en el foco de atención. Actualmente, el más estudiado es la relación entre circRNA y tumores sólidos, así como algunos circRNA que promueven la formación de tumores, como CIRC PVT 1 en carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (Cirs-7) (CDr1as) en cáncer colorrectal, de células escamosas de esófago; expresión de carcinoma y carcinoma hepatocelular. Inhibe los circRNA tumorales, como circsMARCA5 y circ-SHPRH en el glioblastoma.
También hay algunos circRNA que pueden desempeñar diferentes funciones en diferentes tejidos o células, como circHiPK3, que es un protooncogén en el cáncer de recto pero inhibe las células cancerosas en el cáncer de vejiga.
Además del cáncer, las investigaciones también han descubierto que el circRNA está estrechamente relacionado con la diabetes, las enfermedades cardiovasculares, la inflamación crónica y las enfermedades neurológicas. Se cree que con el desarrollo de la biotecnología y una investigación cada vez más profunda sobre el circRNA, la formación y el mecanismo del circRNA pueden volverse más claros y también pueden desempeñar un papel importante en la prevención, detección y tratamiento de enfermedades.
El esquema de eliminación del ARNcirc es difícil de diseñar. Generalmente, se utilizan los dos métodos siguientes:
Opción 1: diseñar dos ARNg en ambos extremos del exón del ARNcirc para desactivar directamente el circular. exón. secuencia del exón. Aunque esta solución es una eliminación total, la eliminación del circRNA también afectará a los genes parentales que codifican las proteínas. Se debe considerar si es factible en función del propósito experimental específico. ?
Opción 2: El knockout se logra destruyendo el bucle formado por el circRNA. Primero es necesario encontrar los elementos en bucle del ARNcirc, que generalmente son los intrones flanqueantes largos ubicados en ambos extremos del exón en bucle. Una vez encontrado el elemento circular, los ARNg se diseñan en ambos extremos para su desactivación, lo que no solo puede destruir los exones de los genes codificantes, sino también eliminar el ARNcirc (Figura 4).
Casos de aplicación:
Circ-HIPK3 es un ARN circular que existe en abundancia en las células humanas. Puede unirse a muchos miARN y actuar como regulador del crecimiento celular, afectando la formación de tumores. Para verificar el mecanismo de formación de bucles de circ-HIPK3, es necesario encontrar los elementos formadores de bucles en los intrones flanqueantes, diseñar un par de sgRNA para los elementos formadores de bucles predichos aguas arriba y aguas abajo, utilizar CRISPR/Cas9 sistema para eliminar los elementos formadores de bucles predichos y detectar circRNA si la expresión ha cambiado. Mediante PCR y RT-QPCR, se descubrió que después de eliminar los elementos formadores de bucles aguas abajo, la expresión de circHIPK3 se reguló significativamente a la baja, mientras que después de eliminar los elementos formadores de bucles aguas arriba, la expresión de circHIPK3 no disminuyó. regulado, pero regulado al alza. Se especula que puede haber demasiadas secuencias de elementos formadores de anillos aguas arriba y la predicción es inexacta. Para verificar aún más que la ciclación es impulsada por otros elementos de ciclación, se inyectó gRNA3 o gRNA4 con gRNA5 o GRNA6**, respectivamente, para eliminar el intrón grande aguas arriba del elemento de ciclación. Los resultados de RT-QPCR mostraron que la expresión de circHIPK3 de hecho se redujo, lo que indica que otros elementos formadores de bucles desempeñan un papel formador de bucles en sentido ascendente.
(Referencia: Zheng, Qin, Bao, Chen, Guo, Li, Chen,... Liang (2016). El mapa circular de ARN revela un abundante bucle 3 que esponja múltiples miARN para regular el crecimiento celular. ? Naturaleza Communications? 7(1), 1-13.)
Entre los métodos para estudiar la función del circRNA, el método más clásico es eliminar el circRNA mediante RNAi (shRNA). Para evitar afectar el ARNm, la secuencia de interferencia debe diseñarse en el sitio de empalme posterior (BSS) en el diseño.
Al diseñar shRNA de alta eficiencia, Yuan Jing Biotechnology transfirió el vector de interferencia a las células mediante el método lentiviral y examinó las células de acuerdo con la concentración óptima de detección de fármacos hasta que todas las células del grupo de control murieron, con lo que murieron. logrando una eliminación estable del circRNA.
Caso de aplicación:
Después de la desactivación con ARNip, se detectó proliferación celular y apoptosis, lo que demostró que la desactivación de circ-HIPK3 inhibía la proliferación celular. Primero, se diseñaron tres conjuntos de experimentos, dirigidos a la transcripción lineal de ARNm de HIPK3, la transcripción circular de circ-HIPK3 y las dos transcripciones * * * se diseñaron en HEK-293? El ARNip diseñado en líneas de células T solo interfiere con la transcripción correspondiente.
Utilice los kits de detección de proliferación y apoptosis celular CCK-8 y EdU para detectar la proliferación celular y la apoptosis. Los resultados mostraron que la eliminación del ARNm de HIPK3 no afectó significativamente la proliferación celular, mientras que la eliminación de circ-HIPK3 inhibió significativamente la proliferación celular.
(Referencia: Zheng, Qin, Bao, Chen, Guo, Li, Chen,... Liang (2016). El mapa circular de ARN revela un abundante bucle 3 que esponja diversos miARN para regular el crecimiento celular. ? Naturaleza Communications? 7(1), 1-13.)
La sobreexpresión de circRNA ha sido difícil, como una baja eficiencia de formación de anillos y un fácil desajuste. Al optimizar los sitios de unión de las RBP, como los elementos ciclistas y QKI, el circRNA se puede circular de manera precisa y eficiente. Después de la sobreexpresión, aún es necesario detectar si el círculo se formó con éxito y si se expresa ARNm lineal. Para estudiar la eficacia del nuevo sistema de expresión del vector de ARN circular, se seleccionó el gen circular 4 de ratón para verificar la expresión en varias líneas celulares (incluidas Hela, N2a y HEK293). Según los datos experimentales de RT-QPCR en diferentes líneas celulares, la eficiencia del nuevo sistema vectorial PCIRRNA-DMO-RTN4 en varias líneas celulares diferentes es mucho mayor que la del sistema vectorial ordinario (PCIRRNA-Be-RTN4).
La transferencia Northern es el estándar de oro para detectar ARNcirc y las sondas suelen diseñarse en sitios de empalme inverso.
Sin embargo, la transferencia Northern requiere una gran cantidad de circRNA, lo que requiere mucho tiempo y trabajo, y las sondas son generalmente radiactivas, lo que dificulta la operación. El esquema de detección comúnmente utilizado es RT-PCR o RT-QPCR, donde los cebadores se diseñan en ambos extremos del sitio de empalme posterior. (Figura 9.
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