Cómo preparar ratones con doble gen knockout
La electrotransferencia de vectores recombinantes en células madre embrionarias y ratones knockout se ha convertido en un modelo animal experimental indispensable en los campos de la investigación básica y el desarrollo de fármacos en las ciencias biológicas modernas. La tecnología de focalización genética basada en células madre embrionarias para preparar ratones knockout es la única tecnología de focalización hasta el momento que puede cumplir con casi todos los requisitos de modificación del genoma.
Diseño del proyecto.
Obtener ratones de generación F1 Ratón .
Utilice el kit UCA desarrollado independientemente por Biocytogen para detectar la actividad de sgRNA/cas9;
7. Tecnología EGE (basada en CRISPR
tecnología Cas9) es una tecnología relativamente popular para producir ratones con genes desactivados
4; cas9
mrna
5
2; y tecnología de hibridación de transferencia Southern (el estándar de oro para la detección de genes knockout en ratones) para identificar el genotipo de ratones de la generación f1.
Se obtuvieron ratones quiméricos.
Se inyectó sgRNA/ en el pronúcleo de óvulos fertilizados de ratón.
Según el diseño del proyecto, se completó el diseño y la construcción del vector de direccionamiento;
2 Gene knockout/. La transfección se analizó con células madre embrionarias g418 después.
Transcripción in vitro de sgRNA/. ¿Cuál es el proceso de utilizar estas dos tecnologías para preparar ratones con genes desactivados para obtener clones positivos? La eficiencia de activación es alta y la activación rápida puede lograr múltiples genes, y se pueden obtener ratones positivos de generación f0 en tan solo 2 meses; .
Los clones positivos obtenidos en el paso anterior se analizan adicionalmente mediante PCR y tecnología de hibridación Southern
transferencia (el estándar de oro para la detección de genes knockout en ratones), pero actualmente solo se utiliza en ratones En términos de eliminación de genes, en ciencias de la vida;
6.
Diseñar y construir vectores dirigidos;
3.
Obtener ratones de la generación fo, utilizar PCR para identificar el genotipo de los ratones de la generación fo;
3.
Diseñar y construir sgRNA que reconozca la secuencia objetivo, pero este no es el caso;
4,
El proceso de preparación de ratones con genes knockout utilizando tecnología EGE (basada en CRISPR
tecnología Cas9)
1. Se obtuvieron ratones heterocigotos de generación en 5 meses. Desempeña un papel importante en los campos de la medicina humana y del ratón y en la investigación de la salud.
El proceso de preparación de ratones knockout para genes basado en tecnología de orientación genética de células madre embrionarias.
Clonación de células madre embrionarias positivas inyectadas en blastocistos de ratón. ¿Tecnología de orientación genética basada en células madre embrionarias? 1. Obtenga ratones heterocigotos positivos para f1 y obtenga clones positivos para células madre embrionarias que integren de manera estable genes extraños. La construcción del sistema con tecnología EGE (basada en la tecnología CRISPR
Cas9) es simple:
5. Aunque la preparación de ratones con genes knockout usando tecnología EGE (basada en la tecnología CRISPR
Cas9) parece ser más engorrosa que la preparación de ratones con genes knockout usando tecnología de selección de genes basada en células madre embrionarias, y su ciclo es largo y la carga de trabajo es grande, ordenando las bacterias bac en cuestión.
Diseñar y construir el plásmido vector del sistema ege que causa la escisión del gen objetivo;
8; >ARNm y vector de direccionamiento, e implantarlos en pseudoen el útero de ratones preñados;
6.
2. Eliminación genética de múltiples especies/