¿Es fácil de utilizar el método microbiológico para la determinación de biotina en alimentos infantiles?

Los métodos para detectar biotina libre en la leche en polvo infantil incluyen métodos microbianos, métodos cromatográficos, métodos de fluorescencia, métodos ELISA, etc. Los métodos microbianos tienen las características de alta sensibilidad. Los métodos microbianos se utilizan generalmente para la determinación en mi país. estándares nacionales e internacionales. Sin embargo, debido a las diferencias en las condiciones de trabajo de varios laboratorios, generalmente es imposible obtener resultados de prueba confiables en estricto cumplimiento de las condiciones de prueba estándar nacionales, lo que resulta en una alta tasa de fallas y altos costos de prueba [1-3]. Por lo tanto, las condiciones de la prueba se simplificaron y optimizaron de acuerdo con la situación del laboratorio del autor, para mejorar la calidad de la prueba y la precisión de los resultados de la prueba, y reducir el costo de la prueba. 1 Materiales y métodos 1.1 Materiales de prueba La cepa de prueba fue Lactobacillus plantarum (ATCC8014), que fue proporcionada por la American Type Culture Collection. El medio de cultivo de prueba fue medio de cultivo en caldo de Lactobacillus (Qingdao Haibo) y medio de cultivo para determinación de biotina libre (Bidi Medical Equipment Co., Ltd.). Estándar de biotina (Shanghai Anpu). Instrumentos y equipos de prueba: espectrofotómetro UV-visible de doble haz TU-1901 (Beijing Puji); incubadora bioquímica LRH-250 (fábrica de equipos médicos de Guangdong); banco de trabajo de purificación SIK-202 (fabricado por Antai Company de Sujing Group); -Esterilizador de vapor a presión vertical 75S (Shanghai Boxun). 1.2 Método de prueba 1.2.1 Preparación de la curva estándar. Los pasos para el procesamiento de la muestra, la preparación de la curva estándar y la medición de la muestra se ajustan a GB5413.19-2010. Durante la inoculación, utilice una jeringa estéril desechable para dejar caer 1 gota de solución bacteriana verticalmente en el aire. Concentración de la solución de trabajo de la curva estándar c=0,2 ng/ml. 1.2.2 Influencia del método de preparación de la solución de curva estándar. Utilice medio de cultivo de caldo Lactobacillus para subcultivar y activar la cepa bacteriana y preparar la suspensión bacteriana con la cepa de cuarta generación. La absorbancia de la suspensión bacteriana es A = 0,57. De la solución intermedia estándar, utilice agua ultrapura y una solución de etanol al 50% para preparar. respectivamente. Se preparó la curva estándar y la prueba se repitió tres veces para cada método. 1.2.3 Efecto de la concentración de la suspensión bacteriana. Utilice medio de cultivo de caldo Lactobacillus para subcultivar y activar las cepas, utilice agua ultrapura para preparar una solución de trabajo de curva estándar y prepare una serie de suspensiones bacterianas de concentración con la cepa de cuarta generación. Las absorbancias (A) de las suspensiones bacterianas son 0,14, 0,22. y 0,36 respectivamente, 0,50, 0,64 y 0,79, respectivamente, para preparar curvas estándar. 1.2.4 Influencia del número de pasajes. Utilice medio de cultivo de caldo de Lactobacillus para subcultivar y activar las cepas, utilice agua ultrapura para preparar una solución de trabajo de curva estándar y prepare suspensiones bacterianas con las cepas de 1.ª, 2.ª, 3.ª, 4.ª, 5.ª y 6.ª generación respectivamente. suspensiones está en orden Para 0,52, 0,54, 0,56, 0,54, 0,60 y 0,55, prepare curvas estándar respectivamente. 2 Resultados y análisis Para examinar el impacto de varios factores en la linealidad de la curva estándar, se consideró el impacto del método de preparación de la solución estándar, la selección del medio de paso, el número de pases y la concentración de la suspensión bacteriana en la linealidad de la curva de prueba. 2.1 La influencia del método de preparación de la solución de curva estándar La curva estándar de la prueba de solución de trabajo estándar que usa una solución de etanol al 50% básicamente no tiene linealidad y no puede cumplir con los requisitos lineales de la prueba, sin embargo, la linealidad de la prueba de curva estándar que usa ultrapura. El agua para preparar la solución estándar se ha mejorado enormemente y se puede alcanzar el máximo de 0,991 2 (Tabla 1, Tabla 2), y los tres resultados cumplieron con los requisitos de la prueba. GB5413.19 requiere el uso de una solución de etanol al 50% para preparar soluciones de trabajo estándar. Sin embargo, debido a la alta temperatura durante el proceso de esterilización y la estanqueidad del tubo de ensayo, el etanol se volatiliza, lo que produce cambios desiguales en el volumen del tubo. tubo de ensayo, lo que resulta en una pobre linealidad de la curva. Al mismo tiempo, debido al etanol mismo, puede inhibir el crecimiento de Lactobacillus plantarum. El etanol en la solución de trabajo estándar afecta el crecimiento microbiano final en la prueba en diversos grados. También es la razón de la mala linealidad o de la falta de linealidad. El uso de agua ultrapura para la preparación puede evitar estos problemas y mejorar eficazmente la linealidad de la curva. 2.2 Efecto de la concentración de la suspensión bacteriana. La linealidad de la curva de absorbancia (A) de la suspensión bacteriana entre 0,50 y 0,79 cumple con los requisitos de la prueba. R2 no cambia mucho dentro de este rango cuando la absorbancia de la suspensión bacteriana alcanza 0,79. la linealidad básicamente cumple con los requisitos de la prueba, el crecimiento excesivo y la absorbancia excesiva en el interior del tubo de ensayo tendrán un cierto impacto en los resultados de la prueba y el tiempo de prueba no debe controlarse. Por lo tanto, la absorbancia de la suspensión bacteriana está entre 0,50 y 0,64. (Figura 1).

La razón por la cual la concentración de la suspensión bacteriana es demasiado baja y la curva de calibración es deficiente puede ser que el tiempo de terminación del crecimiento del tubo de mayor concentración es demasiado largo puede causar la muerte de Lactobacillus plantarum y no consumirlo por completo. biotina del tubo de mayor concentración. 2.3 Influencia del número de pases. Las bacterias de 1 a 5 generaciones pueden cumplir los requisitos de la prueba. Después de 5 generaciones, la linealidad de la curva disminuye significativamente. La posible razón es que a medida que aumenta el número de pases, las cepas mutan y la especificidad. cambios, lo que los hace incapaces de funcionar normalmente. Esto refleja el requerimiento específico de biotina de Lactobacillus plantarum y su incapacidad para crecer linealmente, lo que resulta en una falta de linealidad o una linealidad deficiente en la prueba (Figura 2). 3 Conclusión y discusión Utilice agua ultrapura para preparar la solución de trabajo de la curva estándar, la absorbancia de la suspensión bacteriana A=0,57 y la cepa bacteriana de cuarta generación para preparar la suspensión bacteriana para preparar la curva estándar y=1,023 7x 0,180 8. , R2=0,9962. Se midieron y enriquecieron diferentes muestras. La tasa de recuperación enriquecida promedio fue de 92, y la tasa de recuperación enriquecida osciló entre 85 y 97. La misma muestra se probó repetidamente 10 veces y el coeficiente de variación fue de 3,56. Usando agua ultrapura para preparar la solución de trabajo para la curva estándar y usando cepas bacterianas con una absorbancia A de 0,50 a 0,64 y no más de 5 generaciones para preparar la suspensión bacteriana, la precisión de la prueba es mayor y la reproducibilidad es mejor. Al mismo tiempo, se utilizan 5 puntos de concentración para crear una curva, lo que no solo reduce la carga de trabajo sino que también reduce el costo de detección en comparación con el método estándar nacional. Por lo tanto, esta condición de prueba tiene cierta viabilidad. Durante la prueba, la limpieza de los utensilios, la selección de medios de cultivo comerciales, el paso y activación de cepas utilizando medio de cultivo caldo de Lactobacillus, la preparación de soluciones de trabajo estándar antes de su uso, la jeringa que gotea las cepas debe suspenderse verticalmente y el control. del tiempo de la cultura son todas las pruebas La clave del éxito o del fracaso.