Detección de E. coli O157:H7 utilizando E. coli O157:H7
1. Cultivo de enriquecimiento
2. Aislamiento
3. ) Método del papel de prueba con etiqueta dorada
Este método está estipulado en el "Plan de respuesta de emergencia para diarrea infecciosa enterohemorrágica de China O157: H7" distribuido con frecuencia por el Ministerio de Salud y el Pueblo de China.
Después de que la muestra se someta a un preenriquecimiento y enriquecimiento especial, tome 120 ul de la solución de cultivo de enriquecimiento y colóquelos en la ranura para muestras del clip de prueba. Debido a la acción capilar, la muestra pasa a la zona de reacción, que contiene un anticuerpo especial (anticuerpo E.coliO157:H7) conjugado con partículas de oro coloidal. Si hay un antígeno en la muestra, se combinará con el anticuerpo marcado con oro para formar un complejo antígeno-anticuerpo y avanzará a lo largo de la membrana de nitrocelulosa hasta el área (área T) que contiene el anti-E coli 157 inmovilizado: Anticuerpo H7. El complejo inmunológico marcado con oro. La sustancia se unirá específicamente a los anticuerpos en esta área, formando una línea visible. Otras muestras continúan moviéndose hasta el final de la membrana y eventualmente ingresan al depósito de desechos y son desechadas.
La zona de reacción también contiene un antígeno patentado marcado con oro (indicador de color) que será eluido por la muestra independientemente de si el antígeno E. coli 157:H7:H7 está presente en la muestra. El indicador de control marcado con oro se mueve a través de la membrana hasta el área de control negativo y se une al anticuerpo patentado para formar una línea visible. Independientemente de si hay antígeno de E. coli 157:H7:H7 en la muestra, se formará una línea de control en el área de control (área C) para garantizar una detección normal.
Después de agregar la solución de enriquecimiento gota a gota durante 8 a 10 minutos, observe si hay líneas obvias en las áreas C y T del papel de prueba. Si hay líneas visibles tanto en la zona C como en la T, el resultado es positivo. El área C está cableada y el área T es inalámbrica. El resultado es negativo. Si el área C es inalámbrica, el experimento no será válido independientemente de si hay cables en el área T.
(3) Sistema de detección de rejillas iguales
El sistema de detección ISO-GRID es un sistema de filtración basado en membrana de malla hidrofóbica (HGMF). El sistema utiliza este filtro con 1.600 pequeños cuadrados para detectar o contar microorganismos.
Primero, filtre la muestra diluida con un prefiltro de acero inoxidable de 5um para filtrar las partículas residuales de la muestra que pueden causar errores en el análisis microbiano.
A continuación, la muestra se filtra a través de una membrana de agua del grifo. Luego, los filtros se cultivan en placas de agar específicas para detectar los microorganismos objetivo. Una vez completada la incubación, los microorganismos objetivo se detectan en la membrana y se registra el número de áreas positivas.
La membrana del filtro no se manchará con el color del medio agar, lo que facilita la distinción, identificación y recuento de microorganismos. El método es rápido, sencillo y reproducible. Además de E. coli O157:H7, también es adecuado para la detección y enumeración de salmonella, levaduras, mohos, coliformes y E. coli.
(4) Método de detección del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas monoclonales
Este método sirve para detectar la presencia de E. coli 157:H7 en todos los alimentos. No es una prueba de confirmación. , porque la prueba Los anticuerpos monoclonales utilizados pueden tener una reacción cruzada con pequeñas cantidades de E. coli 157:H7.
Los resultados positivos de la cuarentena deben ser objetivos y deben probarse con un fotómetro con filtro de 450 nm. Un resultado positivo sólo es válido si tanto los controles positivos como negativos tienen lecturas de densidad óptica aceptables.
Principio La detección de E. coli 157:H7 se basa en un inmunoensayo enzimático (EIA) que utiliza anticuerpos monoclonales específicos. La superficie interna de los micropocillos de poliestireno se recubrió con un anticuerpo monoclonal contra el antígeno 157:H7 de E. coli y se agregaron muestras y controles a los micropocillos. Si el antígeno E. coli 157:H7 está presente en la muestra, será absorbido por los anticuerpos específicos adsorbidos en los pocillos. Después del lavado, se añade un agente aglutinante para unirse al antígeno de E. coli 157:H7 adsorbido en el anticuerpo. Enjuague los pocillos nuevamente para eliminar el aglutinante no unido y agregar sustrato enzimático. Cuando se detiene la reacción con la solución de parada, el color azul parece cambiar a amarillo. La presencia o ausencia del antígeno E. coli 157:H7 en la muestra depende de la densidad óptica del color producido.
(5) Método de cribado del sistema automatizado de inmunoensayo de fluorescencia ligado a enzimas (VIDAS)
La identificación del antígeno de E. coli 157:H7 se basa en el inmunoensayo de fluorescencia ligado a enzimas de el instrumento VIDAS. Un dispositivo como una pipeta es un recipiente de fase sólida (SPR), que actúa como fase sólida y absorbente de líquido en un análisis. El SPR está recubierto con una mezcla altamente específica de anticuerpos monoclonales. Se agrega una cierta cantidad de caldo de enriquecimiento a la tira reactiva y la mezcla en el caldo circula dentro y fuera del SPR dentro de un tiempo específico. Si el antígeno E. coli 157:H7 está presente, se unirá al anticuerpo monoclonal recubierto de SPR y otros compuestos no unidos se eliminarán por lavado. Los anticuerpos unidos a la fosfatasa alcalina circulan dentro y fuera del SPR y se unen al antígeno de E. coli 157:H7 unido a la pared interna del SPR. Los conjugados no unidos se eliminan por lavado en el paso de lavado final. El sustrato 4-metilumbeliferona se convierte en el producto fluorescente 4-metilumbeliferona mediante la enzima de la pared SPR. La intensidad de la fluorescencia se midió mediante un escáner óptico. Los resultados experimentales son analizados automáticamente por la computadora, el valor de la prueba basado en la prueba de fluorescencia se compara con el estándar y luego se imprime un informe de resultados positivos o negativos para cada muestra analizada.
(6) Método del medio de cultivo cromogénico de reacción rápida enzimática de contacto de E. coli 157:H7.
La reacción rápida de contacto enzimático se basa en que las bacterias pueden sintetizar y liberar algunas enzimas específicas durante el proceso de crecimiento y reproducción, y en base a las características de la enzima, se seleccionan y formulado en el medio de cultivo correspondiente. Según el cambio de color obvio después de la reacción bacteriana, se determina la cepa sospechosa que se va a aislar. Los resultados de la medición de la reacción son útiles para el diagnóstico rápido de bacterias. Esta tecnología combina orgánicamente la separación bacteriana tradicional con reacciones bioquímicas para hacer que los resultados de la detección sean intuitivos, convirtiéndose en una importante dirección de desarrollo para la detección microbiana en el futuro.
(7) Tecnología de sonda de ADN
La tecnología de sonda de ADN es un método de detección rápido, sensible y específico recientemente desarrollado. Sin embargo, debido a una cierta proporción de reacciones falsas positivas, todos los resultados positivos deben confirmarse mediante métodos de cultivo estándar.
Principio: Utilizar sondas de ADN específicas para detectar el ARN ribosomal (ARNr) de E. coli 157:H7:H7. Después del enriquecimiento previo, el enriquecimiento selectivo y el enriquecimiento posterior, la muestra a analizar disuelve las bacterias. Se añadió la sonda de ADN marcada de E. coli 157:H7:H7 para la hibridación en fase líquida. Si el ARNr de E. coli 157:H7:H7 está presente en la muestra que se va a detectar, la sonda de detección marcada con fluoresceína y la sonda de captura del extremo del nucleótido de polidesoxiadenina (poli da) se hibridarán con la secuencia de ARNr objetivo. Luego se inserta la sonda recubierta con polidesoxitimidina (poliDT) (fase sólida) en la solución de hibridación. El emparejamiento de bases entre PolydA y poldT facilita la captura de la sonda: las moléculas de ácido nucleico híbrido objetivo se unen al soporte sólido y las sondas no unidas se eliminan por lavado. Las sondas se incubaron en cemento antifluoresceína con peroxidasa de rábano picante. El agente aglutinante se une al marcador de fluoresceína presente en la sonda de detección de hibridación y el reactivo no unido se elimina por lavado. La sonda se incuba en una solución de cromógeno-sustrato enzimático y la peroxidasa de rábano picante reacciona con el sustrato enzimático para convertir el cromógeno en un compuesto azul. Una vez que encuentra ácido, la reacción se detiene y el color del cromógeno se vuelve amarillo. El valor de absorción se mide a 450 nm. Si el valor de absorción es mayor que el valor crítico, indica la presencia de E. coli 157:H7:H7 en la muestra a analizar.
Tecnología de reacción en cadena de la polimerasa
Principio de la tecnología PCR Para mejorar la sensibilidad de las sondas de ADN, la secuencia de ADN objetivo se puede amplificar primero para aumentar la cantidad de ADN y lograr una detección suficiente. . Si la reacción se basa en la cinética, se puede analizar cuantitativamente. 1983 Millus y Settles inventaron la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), el método más básico para amplificar el ADN o aumentar el número de fragmentos de nucleótidos específicos en una muestra. El método PCR se basa en tres reacciones repetidas. ① El tratamiento térmico desnaturaliza y escinde el ADN bicatenario en ADN monocatenario (2) Recocido del cebador de extensión con un oligonucleótido específico (3) El cebador de extensión enzimático se empareja con el ADN para sintetizar una plantilla, hibridación del cebador, desnaturalización del fragmento de ADN y hibridación del cebador para formar la plantilla puede participar en la segunda reacción. Los nucleótidos de la solución son polimerizados por enzimas en fragmentos de ADN complementarios, que pueden dividirse nuevamente en ADN monocatenario para convertirse en una plantilla para la siguiente replicación de PCR. Entonces esa cantidad específica de ADN se duplica en cada ciclo. La amplificación típica puede provocar una amplificación de 654,38+0 millones de veces después de 20 a 40 ciclos. La introducción de la Taq polimerasa en la PCR hace que la reacción sea semiautomática y sencilla. La reacción de PCR para amplificar el ADN tiene ventajas incomparables.