Cómo juzgar la calidad de las muestras de ARN cromosómico extraídas
Cómo juzgar la calidad de las muestras de ARN cromosómico extraídas
El ARN total completo producirá bandas claras de ARNr 28S y 18S (muestras eucariotas) cuando se someta a electroforesis en gel desnaturalizante. La intensidad de la banda de ARNr 28S debe ser aproximadamente el doble que la de la banda de ARNr 18S. Esta proporción de 2:1 (28S:18S) es un buen indicador de la integridad del ARN.
Un inconveniente del uso de electroforesis en gel desnaturalizante para evaluar la integridad del ARN es la cantidad de muestra de ARN necesaria para la observación. Normalmente, es necesario cargar al menos 200 ng de ARN en un gel desnaturalizante para visualizarlo con tinción con EtBr. En algunos experimentos de preparación de ARN, como la extracción de ARN de muestras de biopsia con aguja o muestras de microdisección por captura con láser, el rendimiento es muy bajo. En este caso, puede que no sea posible eliminar 200 ng de ARN para evaluar su integridad antes de realizar experimentos de perfiles de expresión. Otros tintes de ácido nucleico, como los tintes de ARN SYBR® Gold y SYBR Green II de Moleculor Probes (Eugene, OR), pueden mejorar significativamente la sensibilidad en comparación con los métodos tradicionales de tinción con EtBr por electroforesis en gel de agarosa. Al utilizar una fuente de luz transmitida de 300 nm (6 bombillas de 15 vatios) y filtros especiales, el tinte en gel SYBR Gold RNA puede detectar tan solo 1 ng de ARN, mientras que SYBR Green II puede detectar tan solo 2 ng, lo que permite el uso de más grandes. Se requieren muestras pequeñas para el análisis de la integridad del ARN.
Actualmente existe un método rápido y sencillo que puede sustituir a los métodos tradicionales de análisis en gel, pudiendo cuantificar y evaluar simultáneamente muestras de ARN. El bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies) es el primer instrumento de microfluidos disponible comercialmente que proporciona información detallada sobre el estado de las muestras de ARN. Cuando se utiliza junto con RNA 6000 LabChip™ (una marca registrada propiedad de Caliper Technologies Corporation), se requiere tan solo 1 µl de muestra a una concentración de 10 ng/µl para cada análisis. Además de evaluar la integridad del ARN, este sistema automatizado también puede proporcionar una evaluación de la concentración y pureza del ARN de la muestra (como la contaminación del ARNr en la preparación de ARNm). En el pasado, para probar la concentración y la pureza era necesario utilizar una parte de la muestra de ARN (mediante espectrofotometría A260) y evaluar la integridad era necesario utilizar una parte adicional de la muestra. Al utilizar el sistema LabChip®, la concentración, la integridad y la pureza se pueden analizar simultáneamente utilizando solo una muestra de 5 ng. Los datos del análisis se pueden mostrar en imágenes similares a geles, diagramas de picos de electroforesis, tablas, etc.