Utilizar después de la fijación con paraformaldehído
La fijación con paraformaldehído es, de hecho, una conversación de larga data. Cuando muchos estudiantes de posgrado están haciendo experimentos, muchos hermanos y hermanas pueden pedirles que lo arreglen con paraformaldehído. Algunos pueden conservar las muestras durante mucho tiempo y tener esperanza. Para concentrarlos, es posible que algunas personas no puedan hacer cola después del teñido y quieran mantener una calidad estable durante mucho tiempo. Así se transmitió de boca en boca.
Problemas de prefijación
Al realizar investigaciones científicas o prácticas clínicas, muchos FLOWER habitualmente pueden prefijar muestras con 4% de paraformaldehído, posiblemente con tres propósitos: (1) Para inactivar microorganismos (bacterias, virus, etc.) que puedan estar presentes en la muestra para garantizar la seguridad. (2) Se espera que las muestras puedan almacenarse durante mucho tiempo. (3) Haga preparativos antes de la tinción intracelular. Sin embargo, muchas personas pueden haber pasado por alto un punto, es decir, si la muestra se fija con paraformaldehído antes de teñir, la conformación de algunos sitios en la superficie celular cambiará después de la fijación, lo que hará que el anticuerpo no pueda unirse y producir falsos negativos. También provocan que otros sitios se dañen debido al efecto de fijación. Los puntos producen unión inespecífica (falsos positivos).
Por lo tanto, es muy importante saber qué anticuerpos no pueden prefijarse antes de la tinción. Afortunadamente, no necesitamos hacer la verificación nosotros mismos. En el sitio web de Biolegend [1], el atento personal técnico ha realizado una serie de pruebas para nosotros. Las dos tablas siguientes, una es el antígeno humano y la otra es el ratón. antígeno, se puede ver Resulta que la mayoría de los anticuerpos que no se pueden prefijar son receptores de quimiocinas, por lo que todos deben tener cuidado de no fijarlos primero y luego teñirlos durante el experimento.
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Tabla 1. Efectos de la prefijación con paraformaldehído al 4% en la tinción superficial de varios anticuerpos (humanos). La fijación tiene un gran impacto.
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Tabla 2. Efectos de la prefijación con paraformaldehído al 4% en la tinción superficial de varios anticuerpos (ratón). Los marcados indican que la prefijación está permitida. Los cruzados indican que la prefijación tiene una gran influencia.
Problemas de fijación post-tinción
La fijación después de la tinción tiene poco que ver con la conformación del antígeno y más con la fluoresceína. En el pasado, cuando había menos de 4 colores, los fluoróforos utilizados no eran en tándem, por lo que la mayoría de ellos tenían poco efecto. Sin embargo, con la aparición de varios tintes en tándem nuevos, la fijación del paraformaldehído se ha convertido en un problema.
De hecho, cuando busque anticuerpos con marcadores de tinción en tándem (como PE-cy7, APC-cy7, etc.), encontrará algunas descripciones más detalladas que indican (busque APC en el sitio web de BD - anticuerpos cy7 como ejemplo):
Las células fijadas deben analizarse dentro de las 4 horas posteriores a la fijación en paraformaldehído o transferirse a un tampón sin paraformaldehído para su almacenamiento durante la noche.
Esto significa usar más Las muestras fijadas con paraformaldehído deben analizarse en un plazo de 4 horas; de lo contrario, el tinte en tándem puede degradarse fácilmente. Si se almacena durante mucho tiempo, aún es necesario lavarlo y transferirlo a un tampón que no contenga paraformaldehído.
Cabe señalar que los estudiantes que realizan detección de fluorescencia de GFP también deben prestar atención al hecho de que la fijación de paraformaldehído también afectará a GFP. Paul A. Lucas del New York Medical College cree que esto se debe al paraformaldehído. fijación. No apaga la fluorescencia de GFP, pero cambia la conformación de la proteína GFP, haciéndola incapaz de producir fluorescencia [2]. A veces, la fluorescencia que se detecta después de la fijación puede ser autofluorescencia o puede ser emitida por la GFP restante que no ha cambiado su conformación.
Solución
1. Si detecta moléculas que se ven fácilmente afectadas por el paraformaldehído en la tabla anterior, intente no fijarlas previamente si necesita conservar la muestra. mucho tiempo, se puede considerar congelar la muestra.
2. Si detecta moléculas que no se ven afectadas por el paraformaldehído en la tabla anterior, puede prefijarlas y conservarlas con 1% de paraformaldehído, pero no se pueden usar durante mucho tiempo, de lo contrario. afectará la célula FSC, SSC y la fuerza tiene un gran impacto. En este momento, puede considerar usar FlowGuard? Cell Preservation Solution [3] de Flow Cytometry Chinese Network. FlowGuard? es un producto original patentado nacional que no contiene paraformaldehído y puede liberar lentamente un componente especial débilmente fijado. son relativamente pequeños. El paraformaldehído es suave y mantiene la fuerza del antígeno durante un período de tiempo más largo Muestra: solución de conservación = 6:1 ~ 10:1 Los resultados de la prueba son estables en 21 días.
3. Si quieres mantener la fluorescencia estable durante unas 24 horas después del teñido, la primera opción es evitar la luz y los 4 grados. Hemos utilizado 10 colores (BV405, KO, FITC, PE, ECD). , PE-cy5.5, PE-cy7, APC, APC-A700, APC-cy7) durante las pruebas informales del esquema de citometría de flujo, se midieron varios casos después de haber sido almacenados en la oscuridad a 4 grados durante 24 horas. La intensidad de la fluorescencia casi no cambia y las células se agrupan bien.
Si todavía estás preocupada, puedes considerar comprar un agente de conservación especial comercial adecuado para tintes en tándem