Secuenciador de ADN
Sin embargo, me gustaría decir que actualmente la secuenciación del ADN todavía se basa en el principio de Sanger, pero la sensibilidad mejora al combinar tintes fluorescentes.
Principios y métodos de secuenciación de ADN
La secuenciación de ADN se puede dividir en secuenciación manual y secuenciación automática. La secuenciación manual incluyó la terminación de la cadena didesoxi de Sanger y la degradación química de combinación no polar-Gilbert. De hecho, la secuenciación automatizada se ha convertido en la corriente principal del análisis de secuencias de ADN. La empresa estadounidense PE ABI produce secuenciadores de ADN 373, 377, 310, 3700 y 3100, de los cuales el 310 es el modelo más utilizado en los laboratorios de pruebas clínicas. Este experimento presenta los principios de secuenciación y los procedimientos operativos del secuenciador de ADN ABI PRISM 310.
El analizador genético Principie ABI PRISM 310 (es decir, el secuenciador de ADN) utiliza tecnología de electroforesis capilar en lugar de la electroforesis tradicional en placas de poliacrilamida, utilizando el ddNTP (método de terminador etiquetado) patentado de cuatro colores con tinte fluorescente marcado por la compañía, por lo que a través de un reacción de secuenciación de PCR con cebador único, el producto de PCR generado es una mezcla de ADN monocatenario con cuatro tintes fluorescentes diferentes en el extremo 3 '', que difieren en 1 base, de modo que los productos de secuenciación de PCR de los cuatro tintes fluorescentes pueden estar en el La electroforesis capilar del medio evita la influencia de las diferencias de movilidad entre carriles. Debido a los diferentes tamaños moleculares, la movilidad en la electroforesis capilar también es diferente. Un detector de cámara CCD (dispositivo de carga acoplada) en la ventana del detector láser puede detectar moléculas fluorescentes una por una a medida que pasan a través de la ventana de lectura capilar. La fluorescencia excitada se segmenta mediante una rejilla para distinguir diferentes colores de fluorescencia que representan información diferente del sustrato, y las imágenes se sincronizan en una cámara CCD. El software de análisis puede convertir automáticamente diferentes fluorescencias en secuencias de ADN para lograr el propósito de la secuenciación del ADN. Los resultados del análisis se pueden generar en diversas formas, como patrones de electroforesis en gel, patrones de picos de absorción de fluorescencia o secuencias de disposición de bases.
Es un instrumento de precisión avanzado que utiliza control automático por ordenador, como llenado automático de gel, muestreo automático, recogida y análisis automático de datos, para medir la secuencia de bases, el tamaño y la cuantificación de fragmentos de ADN. PE también ofrece polímeros en gel, incluidos geles de secuenciación de ADN (POP 6) y geles GeneScan (POP 4). Los tamaños de poro de estas partículas de gel son uniformes, lo que evita el impacto de condiciones de preparación de gel inconsistentes en la precisión de la secuenciación. Consiste principalmente en un dispositivo de electroforesis capilar, una computadora Macintosh, una impresora a color y accesorios de electroforesis. Las computadoras incluyen software para la recopilación de datos, el análisis y la operación de instrumentos. Utiliza el último detector de cámara CCD para acortar la secuenciación de ADN a 2,5 horas y el análisis del tamaño de los fragmentos de PCR y el análisis cuantitativo de 10 a 40 minutos.
Debido a que el instrumento tiene las funciones de secuenciación de ADN, análisis del tamaño de fragmentos de PCR y análisis cuantitativo, puede realizar secuenciación de ADN, análisis heterocigótico, análisis de polimorfismo de conformación de cadena única (SSCP), análisis de secuencia de microsatélites y fragmento largo. PCR, RT-PCR (PCR cuantitativa) y otros análisis. Además de la secuenciación de ADN convencional, también puede realizar análisis de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP), detección de mutaciones genéticas, comparación de HLA y medicina forense.
Reactivos y Equipos
Reactivos principales para 1. El kit de reacción de secuenciación Big Dye es BigDye Mix, que contiene ddNTP marcados con fluorescencia de cuatro colores y dNTP ordinarios patentados por PE, ADN polimerasa FS AmpliTaq, tampón de reacción, etc.
2.PGEM-3ZF (+) plantilla de control de ADN bicatenario 0,2 g/L, kit de reactivos de soporte.
3.M13 (-21) cebador TGTAAAACGACGGCCAGT, 3,2μmol/L, es decir, 3,2pmol/μl, es el reactivo del kit.
4.La plantilla de secuenciación de ADN puede ser producto de PCR, ADN monocatenario y ADN plasmídico. Es necesario ajustar la concentración de la plantilla y 1 µl es apropiado para la reacción de PCR. La concentración de ADN plasmídico medida en este experimento es de 0,2 g/L, es decir, 200 ng/μ L.
5. Los cebadores deben diseñarse cebadores directos o inversos en función del fragmento de ADN que se va a probar. y preparar 3,2 μmol/L, es decir, 3,2 pmol/μ L. Si el plásmido recombinante contiene una secuencia de cebador universal, también se pueden utilizar cebadores universales, como el cebador M13(-21) y el cebador T7.
6. Desinfectar con agua desionizada o agua triple destilada.
7,0,2ml o separado del tapón del tubo PCR de 0,5ml, producto de la empresa PE.
8,3 mol/L de acetato de sodio (pH 5,2): Pesar 40,8 g de NaAc·3H2O y disolverlo en 70 ml de agua destilada. Ajustar el pH a 5,2 con ácido acético glacial, ajustar el volumen a 100 ml y esterilizar en autoclave. antes del embalaje.
Etanol 9,70% y etanol absoluto.
10. Mezclando 37,5 ml de etanol absoluto y 2,5 ml de acetato de sodio 3 mol/L, la mezcla de etanol NaAc se puede almacenar a temperatura ambiente durante 65438±0 años.
11.pop6 gel secuenciador producto ABI.
12. Productos ITB inhibidores de plantilla (TSR).
13,10× tampón de electroforesis producto ABI.
14.Secuenciador automático de ADN ABI Prism310.
Instrumento PCR 15.2400 o 9600.
16. Centrífuga refrigerada de alta velocidad de sobremesa.
17. Centrífuga de sobremesa de alta velocidad o centrífuga de bolsillo.
Procedimientos operativos
1. Reacción de secuenciación por PCR
(1) Tome un tubo de ensayo de PCR de 0,2 ml, numérelo con un marcador e inserte el tubo de ensayo. en hielo granulado y agregue los reactivos de acuerdo con la siguiente tabla:
Tubos de control estándar para tubos de plantilla de medición con reactivos agregados
Mezcla BigDye 1 μl 1 μl
ADN plásmido 1 μ l-
PGEM-3Zf (+) ADN bicatenario-1 μ l
Cebador directo 1 μ l-
M13( - 21) Primer-1μl
2 μl de agua desionizada estéril 2 μl
Volumen total de reacción 5μl, sin aceite mineral ligero ni aceite de parafina, tapa del tubo de PCR Apriete el tubo con los dedos para mezclar y centrifugar ligeramente.
(2) Coloque el tubo de PCR en la máquina de PCR 9600 o 2400 para su amplificación. Después de desnaturalizar a 98 °C durante 2 minutos, realice un ciclo de PCR. Los parámetros del ciclo de PCR fueron 96 °C durante 10 s, 50 °C durante 5 s y 60 °C durante 4 min, 25 ciclos. Después de la amplificación, la temperatura se ajustó a 4°C.
2. Purificar los productos de PCR mediante el método de acetato de sodio/etanol.
(1) Centrifugar la mezcla y transferir el producto de amplificación a un tubo EP de 1,5 ml.
(2) Agregue 25 μl de solución mixta de acetato de sodio/etanol, agite bien y colóquelo en hielo durante 65438 ± 00 min para precipitar el ADN. Centrifugar a 12.000 rpm durante 30 min a 4°C y desechar con cuidado el sobrenadante.
(3) Añadir 50 μl de etanol al 70% (V/V) para lavar el precipitado dos veces. Centrifugar a 12 000 r/min durante 5 minutos a 4°C, desechar con cuidado el sobrenadante y las perlas de la pared del tubo y secar al vacío el precipitado durante 10 a 15 minutos.
3. Procesado de productos de secuenciación PCR antes de la electroforesis.
(1) Agregue 12 μl de TSR al tubo de centrífuga, agite vigorosamente para disolver completamente el precipitado de ADN y centrifugue ligeramente.
(2) Transfiera la solución a un tubo de PCR de 0,2 ml, abra la tapa y centrifugue ligeramente.
(3) Realice la desnaturalización térmica en una máquina de PCR (95 °C durante 2 minutos) y luego enfríe en hielo.
4. Instale el capilar según las instrucciones de funcionamiento del instrumento, corrija la posición del capilar, llene manualmente el gel y cree un archivo de secuencia de secuenciación. El instrumento inyectará automáticamente pegamento en el capilar, realizará 65 minutos de preelectroforesis de 438+0,2 kV durante 5 minutos, inyectará muestras automáticamente según la secuencia programada, 65 minutos de preelectroforesis de 438+0,2 kV durante 20 minutos y 7,5 Electroforesis kV durante 2 horas. Después de la electroforesis, el instrumento limpia automáticamente, vierte gel, alimenta la siguiente muestra, realiza una preelectroforesis y realiza la electroforesis. El tiempo total de electroforesis para cada muestra es de 2,5 horas. Una vez completada la electroforesis, el instrumento analizará o imprimirá automáticamente un mapa de secuenciación en color.
5. El instrumento realizará automáticamente un análisis de secuencia y podrá realizar una comparación de secuencia según los requisitos del usuario. Si se conoce la secuencia de secuenciación, puede marcar diferentes bases con asteriscos mediante la alineación de secuencias para mejorar la eficiencia del trabajo.
6. Después de la secuenciación, limpiar y mantener el instrumento según sus normas de funcionamiento.
Cálculo
La fórmula de cálculo para la precisión de la reacción de secuenciación es: 100%-número de bases de diferencia (excluyendo el número N)/650×100%.
Las bases de diferencia se refieren a bases donde la secuencia de ADN determinada es diferente de la secuencia de ADN estándar conocida, y N es la base que el instrumento no puede leer.
Notas y comentarios
1. El analizador genético ABI prism 310 es un instrumento de precisión de alta gama que requiere personal dedicado para su operación, gestión y mantenimiento.
2. El volumen total de la reacción de secuenciación de PCR en este experimento es de 5 μl y no está cubierto con aceite mineral, por lo que el sellado de la tapa del tubo de PCR es muy importante. Además de cerrar la tapa del tubo de PCR después de agregar los reactivos, es mejor utilizar tubos de PCR de empresas de PE. Si la solución de PCR después de la PCR es inferior a 4 ~ 4,5 μl, la reacción de PCR puede fallar y no se requieren purificación ni carga.
3. Como usuarios de secuenciación, sólo necesitan proporcionar muestras de ADN purificado y cebadores. Se utilizan diferentes plantillas en la secuenciación de reacciones de PCR, por lo que la cantidad de ADN necesaria es diferente. La secuenciación por PCR requiere una pequeña cantidad de plantilla. Generalmente, los productos de PCR requieren de 30 a 90 ng, el ADN monocatenario requiere de 50 a 100 ng y el ADN de doble cadena requiere de 200 a 500 ng. La pureza del ADN es generalmente de 260 nm/a. , y se prepara con agua desionizada o Es mejor preparar los cebadores con agua destilada a 3,2 pmol/μL.
4. El kit de secuenciación utilizado en este experimento es el kit de secuenciación de ciclo de sustrato de terminación marcado fluorescente BigDye. La longitud del ADN generalmente medible es de aproximadamente 650 pb. La precisión de la secuenciación de ADN con este instrumento es (98,5 ± 0,5) % y el número de bases que este instrumento no puede leer es inferior al 2 %. Si la longitud a medir supera los 650 pb, es necesario diseñar otro cebador.
Para garantizar una secuenciación más precisa, se pueden diseñar cebadores inversos para secuenciar la misma plantilla y verificarse entre sí. Las n bases pueden comprobarse manualmente y, en ocasiones, leerse en voz alta. Para mejorar la precisión de la secuenciación, según las posiciones indicadas por los asteriscos, el mapa de colores se puede analizar manualmente para verificar más a fondo las bases.