Construcción de la biblioteca de transposasa NGS012 y ATAC-seq
Una secuencia de ADN se puede copiar o romper por separado del sitio original, circularizada e insertada en otro sitio, y regula los genes posteriores. Este proceso se llama transposición. Esta secuencia se llama gen saltador o transposón. Los transposones son unidades básicas que existen en el ADN cromosómico y pueden replicarse y moverse de forma independiente.
La enzima que realiza la función de transposición suele estar codificada por un transposón. Reconoce las secuencias específicas en ambos extremos del transposón y puede separar el transposón de la secuencia adyacente y luego insertarlo en una nueva diana de ADN. Sitio, sin requisito de homología.
Los transposones incluyen secuencias repetidas invertidas en ambos extremos y un gen transponible en el medio. La secuencia repetida invertida es donde se une la transposasa, y el gen transponible en el medio es el segmento genético que salta de un gen a otro.
Tn5 tiene una longitud total de aproximadamente 5,8 kb y consta de una secuencia central que codifica tres antibióticos (neomicina, bleomicina y estreptomicina) y dos secuencias IS50 invertidas, de las cuales IS50R e IS50L son altamente homólogas. con una sola base de IS50L mutada. IS50 tiene un extremo invertido de 19 pb (extremo exterior, OE y extremo interior, IE). Los dos extremos invertidos son diferentes en 7 pb. Este extremo invertido es el sitio de acción de la transposasa (Tnp). Tanto IS50L como IS50R contienen genes que codifican la transposasa (TnP) y la proteína represora de transposición (lnh). Sin embargo, debido a la mutación de la base en IS50L, la traducción finaliza prematuramente, por lo que solo IS50R puede producir TnP y lnh activos normales.
Cuando se produce la transposición, dos moléculas de transposasa se unen a los extremos OE del transposón Tn5 para formar dos complejos Tnp-OE. Posteriormente, los dos complejos se asocian y los extremos interactúan y se escinden para formar un complejo sinaptonémico. Compuesto por una proteína dimérica y dos moléculas de ADN. Sólo después de la formación del complejo sinaptonémico el Tnp tiene la actividad de cortar el ADN. La formación de esta estructura favorece la escisión y transferencia coordinadas de la cadena de ADN Tn5 y ayuda a evitar que Tnp corte solo un extremo de la cadena de ADN del transposón. El Tnp unido al extremo izquierdo es responsable de catalizar la hidrólisis del enlace fosfodiéster en el extremo derecho, mientras que el Tnp unido al extremo derecho es responsable de catalizar la hidrólisis del enlace fosfodiéster en el extremo izquierdo. Al activar las moléculas de agua Tn p, esta molécula de agua activada hidroliza la cadena de ADN, formando dos grupos nucleofílicos 3'-OH en ambos extremos de Tn5. Los grupos nucleofílicos luego atacan la cadena complementaria para formar una estructura en horquilla. Luego, otra molécula de agua activada hidroliza la estructura en horquilla para formar Tn5 de extremos romos, y todo el complejo sinaptonémico abandona la hebra donante y se une al ADN objetivo. El 3'-OH de Tn5 ataca nucleófilamente a la secuencia objetivo, formando un extremo pegajoso de 9 pb entre el sitio de inserción del transposón, y se forma una valencia positiva entre el 3'-OH del transposón y el 5'-P del ADN objetivo. , el transposón se inserta en la secuencia objetivo. El espacio se llena bajo la acción de la ADN polimerasa y se forma una secuencia de repetición directa de 9 pb en ambos extremos del transposón. Todo el proceso de transposición completa el proceso de cortar genes del ADN original y luego pegarlos en el ADN de otro receptor, logrando un "salto" genético (en la foto).
ATAC-seq, también conocido como ensayo de cromatina accesible por transposasa con secuenciación de alto rendimiento, es una tecnología de secuenciación de alto rendimiento que utiliza transposasa para explorar la cromatina accesible.