¿A qué se debe prestar atención durante los experimentos de transfección de ARNip?

Durante el experimento de transfección, preste atención a los siguientes puntos: a Purificación de ARNip: Confirme el tamaño y la pureza del ARNip antes de la transfección. Para obtener ARNip de alta pureza, se recomienda combinar con fibra de vidrio y eluir o eliminar el exceso de nucleótidos, oligonucleótidos pequeños, proteínas e iones de sal en la reacción a través de un gel de acrilamida al 15% y al 20%.

Tenga en cuenta que el ARN sintetizado químicamente generalmente debe purificarse mediante electroforesis en gel (es decir, purificación en gel PAGE).

Evite la contaminación con ARNasa: una pequeña cantidad de ARNasa puede provocar experimentos con ARNip. fracasar. Debido a que la RNasa es omnipresente en el entorno experimental, como la piel, el cabello y todo lo que se toca con las manos o se expone al aire, es muy importante garantizar que cada paso del experimento no esté contaminado por la RNasa.

C. El cultivo de células sanas y el funcionamiento estricto garantizan la reproducibilidad de la transfección: generalmente, la eficiencia de la transfección de las células sanas es mayor y un menor número de pases puede garantizar la reproducibilidad de las células utilizadas en cada experimento. estabilidad. Para optimizar el experimento, se recomienda transfectar células por debajo de 50 generaciones; de lo contrario, la eficiencia de la transfección disminuirá significativamente con el tiempo.

D. Evitar el uso de antibióticos: Ambion recomienda evitar el uso de antibióticos desde el momento de la implantación celular hasta 72 horas después de la transfección. Los antibióticos acumulan toxinas en las células infiltradas. Al transfectar ARNip, algunas células y reactivos de transfección requieren condiciones sin suero. En este caso, puede utilizar medio normal y medio sin suero para experimentos comparativos para obtener el mejor efecto de transfección.

E. Seleccione el reactivo de transfección adecuado: dependiendo del método de preparación de ARNip y el tipo de célula objetivo, seleccionar un buen reactivo de transfección y optimizar la operación son cruciales para el éxito del experimento de ARNip.

F. Optimizar las condiciones de transfección y detección con controles positivos adecuados: Los genes de mantenimiento son buenos controles positivos para la mayoría de las células. Transfiera el ARNip de control positivo en diferentes concentraciones a las células objetivo (también aplicable al ARNip objetivo experimental 48 horas después de la transfección, calcule el nivel de reducción de la proteína de control o ARNm en relación con las células no transfectadas). Un exceso de ARNip puede provocar toxicidad celular e incluso la muerte.

G. Optimizar experimentos marcando ARNip: el ARNip marcado con fluorescencia se puede utilizar para analizar la estabilidad y la eficiencia de transfección del ARNip. El ARNip marcado también se puede utilizar para la localización intracelular de ARNip y experimentos de doble etiquetado (usando anticuerpos marcados) para rastrear las células en las que se introduce el ARNip durante la transfección, combinando la transfección con la regulación negativa de la expresión de la proteína diana.