Guía de etiquetas Fusion
Una etiqueta de purificación es una proteína o péptido conocido que se puede fusionar con la proteína de interés. Debido a que estas etiquetas son fáciles de identificar, hay muchos anticuerpos para elegir y son muy fáciles de detectar. El principal método de marcaje es el ADN recombinante, es decir, integrar el ADN codificante que porta la proteína de interés con el marcador y transferir el plásmido al interior de la célula. Cuando se exprese el plásmido, la etiqueta de fusión se adherirá a su proteína.
La elección de la etiqueta de fusión es muy importante, al igual que la elección de la secuencia enlazadora. La secuencia enlazadora conecta su proteína con la etiqueta para garantizar que la proteína se pliegue correctamente y funcione correctamente.
¿Por qué utilizar etiquetas de fusión?
Ventajas:
(1) Proteína aislada, aunque no exista anticuerpo específico contra la proteína.
(2) Después de la purificación, la etiqueta de fusión debe cortarse si es necesario.
(3) Se pueden unir varias etiquetas a la misma proteína para múltiples propósitos.
(4) Evitar la interferencia de anticuerpos durante el proceso de inmunoprecipitación.
(5) El marcaje fluorescente se puede utilizar para observar proteínas en células vivas.
Desventajas:
(1) Algunas etiquetas afectarán la función de las proteínas.
(2) Es necesario optimizar la posición de la etiqueta.
Este artículo solo presenta varias etiquetas. No puede decir qué etiqueta debe colocarse en qué posición. Depende completamente de sus necesidades experimentales.
Si no está seguro de dónde es mejor su etiqueta, debe probar varias opciones, como cambiar o agregar un sitio de proteasa, modificar la secuencia del enlazador o agregar varias etiquetas para diferentes propósitos.
Actualmente, existen tres tipos principales de etiquetas de fusión:
Etiquetas de epítopos: generalmente secuencias peptídicas cortas, que pueden usarse para aplicaciones de tecnología inmunológica, como WB y Co-IP.
Etiqueta de afinidad: generalmente de tipo largo, se puede utilizar para la purificación de proteínas o para aumentar la solubilidad de las proteínas.
Marcado fluorescente: se puede utilizar para células vivas/células muertas, generalmente utilizado para experimentos de imágenes, como posicionamiento celular y experimentos de expresión * * *.
Todo depende de la proteína que quieras estudiar: ¿Cómo se pliegan las proteínas? ¿Qué extremo es funcional? Por ejemplo, si el extremo C está plegado dentro de la proteína, no podrá detectar la señal de la etiqueta de fusión o si su proteína se cortará en un extremo después de la traducción, entonces su etiqueta también se cortará; .
Si no sabes cómo se pliega tu proteína, lo mejor es probar tanto el C-terminal como el N-terminal cuando lo hagas por primera vez. Se ha informado que las proteínas de fusión C-terminales están más localizadas en las regiones celulares esperadas que las proteínas de fusión marcadas en el extremo N-terminal. Pero eso no es del todo cierto.
No todas las etiquetas son iguales: cada una tiene sus propios usos y limitaciones. Por ejemplo, necesitas hacer que tu proteína sea más soluble y usar una etiqueta para purificarla. Purificación por afinidad en tándem (TAP). TAP originalmente se refería a la fusión de una serie de dominios específicos en proteínas: el péptido de unión a calmodulina (CBP) y la proteína A (ProtA) de Staphylococcus aureus, que están separados por el sitio de escisión del virus del grabado del tabaco (TEV). Sin embargo, esta tecnología ahora se puede utilizar para fusionar 2 o 3 etiquetas de fusión en una proteína, pero normalmente todavía contiene el componente TAP original. Estas etiquetas se pueden fusionar a uno o ambos extremos de la proteína. Si es necesario cortar las etiquetas después de su uso, generalmente se recomienda colocarlas en serie.
Su etiqueta es muy utilizada en TAP porque es muy pequeña y muy eficaz para experimentos de purificación. A menudo se utiliza con la proteína fijadora de maltosa (MBP) para aumentar la solubilidad. Otra combinación comúnmente utilizada es GFP e His.
Aunque la etiqueta TAP tiene muchas ventajas, es muy grande y puede destruir la función de la proteína. Además, si usa una etiqueta que contenga CBP, puede interferir con la señalización del calcio. Por lo tanto, ponga la menor etiqueta posible a su proteína.
Algunas etiquetas pequeñas tienen poco impacto en la función de las proteínas, pero algunas etiquetas grandes pueden tener efectos inesperados. En este caso, normalmente tendrás que cortar la etiqueta después de probarla. Esto requiere el uso de proteasas o péptidos específicos de sitio.
En teoría, las proteasas específicas de sitio no afectarán la función proteica. Sin embargo, las proteasas normalmente se eliminan después de la escisión. Una solución es fusionar la proteasa con la etiqueta y eliminarla mediante cromatografía de afinidad. La elección de varios sitios de reconocimiento de proteasas depende de sus necesidades. Una cosa a tener en cuenta es: ¿la etiqueta de fusión está en el terminal N o en el terminal C? Cortar la etiqueta del extremo N dejará menos residuos, mientras que cortar la etiqueta del extremo C dejará entre 4 y 6 residuos más en la proteína. La siguiente es una lista de varios sitios de proteasas comúnmente utilizados (versión en inglés, compruébela usted mismo si es necesario):
Las etiquetas de afinidad se llaman así porque a menudo se usan para la purificación por afinidad. La purificación por afinidad es una técnica para purificar proteínas a partir de lisados celulares. Vea la imagen a continuación:
GST es una proteína compuesta por 211 aminoácidos, con un tamaño molecular de aproximadamente 26 KD.
El GST natural protege las células de los componentes nocivos y del estrés oxidativo. GST se caracteriza por su afinidad por los tripéptidos y el glutatión, y puede usarse para cromatografía de afinidad. Cuando una solución que contiene GST pasa a través de una columna con glutatión inmovilizado, el GST se une al glutatión y se separa de la solución. Después de la unión, se puede utilizar glutatión 10 mM para la elución.
Notas:
(1) Contaminación: las proteínas de choque térmico a veces son eluidas por GST. Puede ver esta contaminación en un gel SDS-PAGE. Para eliminar la contaminación de proteínas de choque térmico, el lisado celular se puede tratar con cloruro de calcio 5 mM y ATP 5 mM antes de la purificación.
(2) Pérdida de la función proteica: dado que GST es una etiqueta grande, generalmente existe en forma de dímeros en la solución. Puede reducir la actividad y función de las proteínas. La escisión se puede realizar usando proteasas tales como trombina, factor Xa o proescisión.
Las etiquetas PolyHis se utilizan ampliamente en la purificación de proteínas debido a su pequeño tamaño y su unión estable. Aunque las etiquetas His pueden tener de 2 a 10 residuos de histidina, la más comúnmente utilizada es la etiqueta 6×His, o hexatag. La histidina forma enlaces de coordinación con iones de metales de transición fijos y puede usarse para la purificación de proteínas. Las columnas de cobalto y zinc se pueden utilizar en cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC), pero normalmente se utilizan columnas de níquel. Debido a que las etiquetas His son secuencias peptídicas cortas, la posición óptima de la etiqueta depende de la especificidad de la proteína y rara vez afectan las propiedades de la proteína de fusión.
Notas:
(1) His endógeno: los residuos de His están ampliamente presentes en mamíferos e insectos, por lo que tienen una señal de fondo alta. El lavado con imidazol de 5 a 10 mM puede evitar la unión de fondo, pero esto eliminará la proteína prematuramente. Además, cuando se utiliza el anticuerpo His para la detección, también se debe prestar atención a la unión del fondo.
(2) No se recomienda fusionar proteínas con centros metálicos a la etiqueta His porque el metal puede ser absorbido por la resina de afinidad.
(3) Se deben evitar agentes reductores como el ditiotreitol (DTT) o el β-mercaptoetanol, ya que reducirán la afinidad de la resina.
La biotina, también conocida como vitamina H, es una pequeña molécula con un peso molecular de 244Da. Suele estar unido a anticuerpos secundarios como técnica de visualización para ELISA y WB. La biotina puede formar una unión muy fuerte a las moléculas de estreptavidina y avidina y puede usarse para la purificación por afinidad. Debido a que la biotina es una molécula pequeña, no afecta la función de las proteínas. Otra etiqueta valiosa es la etiqueta de estreptococo. Debido a que tiene 8 aminoácidos de longitud (WRHPQFGG), no afecta la función de las proteínas y se une de manera reversible a la biotina en el mismo bolsillo. Esto significa que las proteínas fusionadas con Strep-tag se pueden purificar eficazmente utilizando resina de estrptavidina y eluir con biotina en condiciones suaves de tampón.
Notas:
(1) Resina de afinidad para tetrámeros y monómeros: las columnas recubiertas de biotina se pueden usar para purificar proteínas marcadas con biotina, y las proteínas pueden ser tetrámeros o usarse en forma única. . El proceso de elución de columnas cromatográficas de abidina tetramérica requiere desnaturalizantes fuertes, como urea o clorhidrato de guanidina, mientras que la resina monomérica se puede eluir suavemente con tampón de biotina 10 mM.
(2) El sistema de los mamíferos contiene al menos cuatro proteínas biotiniladas que eluirán con la proteína de interés. Sin embargo, rara vez se encuentra unión inespecífica en los sistemas de E. coli.
Un epítopo es una parte de un antígeno que es reconocido por anticuerpos. Por lo tanto, las etiquetas de epítopos se utilizan a menudo en ensayos basados en anticuerpos. Las etiquetas de epítopo son generalmente más cortas que las etiquetas de afinidad y, por lo tanto, rara vez afectan la función de las proteínas. Aunque también se pueden utilizar para la purificación por afinidad, las columnas basadas en inmunoanticuerpos son caras y no tan eficientes como las etiquetas de afinidad. Las etiquetas de epítopos tienen grandes ventajas en la detección. Ampliamente utilizado en cultivo celular e inmunoprecipitación.
El c-myc humano se expresa en niveles bajos en células en proliferación y juega un papel importante en la tumorigénesis humana. La etiqueta c-myc se deriva del extremo C del gen C-myc y puede ser reconocida eficazmente por anticuerpos. Por tanto, es ampliamente utilizado en la detección de proteínas, como WB, inmunoprecipitación, citometría de flujo, etc.
Notas:
(1) Fusión en señalización secretora: aunque la etiqueta c-myc se puede colocar en el terminal N o C de la proteína, no se recomienda fusionarse en la vía de señalización secretora Afectará el posicionamiento de las vías de señalización secretora.
(2) Purificación por afinidad: Aunque también se puede utilizar para la purificación de proteínas, rara vez se utiliza. Esto se debe a que la elución debe realizarse a un valor de pH muy bajo, lo que afectará la función de la proteína.
La etiqueta hemaglutinina (HA) del virus de la influenza humana se deriva de la glicoproteína HA, que está presente en la superficie del virus de la influenza y es responsable de la infectividad del virus. Dado que HA es una etiqueta peptídica pequeña, básicamente no afecta la función de la proteína y puede usarse para la detección de proteínas, como ELISA, WB, inmunoprecipitación, etc. Los anticuerpos anti-HA también se pueden utilizar para la purificación de proteínas.
Notas:
Purificación por afinidad: No se recomienda la etiqueta HA para marcar proteínas en células apoptóticas. La etiqueta HA es escindida por la caspasa 3 y la caspasa 7, lo que da como resultado una inmunorreactividad disminuida.
DDDK o FLAG son etiquetas patentadas únicas (sigma) que son más hidrófilas que otras etiquetas de epítopos. Si se desea, la secuencia de escisión de enteroquinasa contenida en la etiqueta DDDK puede escindir la etiqueta de la proteína de fusión.
Notas:
Purificación por afinidad: aunque los anticuerpos anti-DDDK también pueden purificar proteínas de forma eficaz, suelen ser más caros que otras columnas.
La etiqueta V5 se deriva de la proteína P y la proteína V del virus del simio paramixovirus. Las etiquetas V5 están disponibles en dos tamaños, de 9 a 14 aminoácidos. Pero comúnmente se usan los más largos. A veces, las etiquetas V5 se utilizan en combinación con etiquetas His.
Nota:
Reactividad cruzada: Si se utilizan sistemas de expresión de mamíferos, puede producirse reactividad cruzada.
Desde 1992, se ha clonado el gen GFP y actualmente se encuentran disponibles muchas etiquetas fluorescentes. Una de las mayores ventajas de las etiquetas fluorescentes es que no son tóxicas, por lo que pueden usarse en células vivas. Aunque las etiquetas fluorescentes son grandes, tienen poco impacto en la mayoría de las funciones de las proteínas.
Si bien GFP es un marcador fluorescente de 26,9 KD, hay muchos otros marcadores disponibles.
Si piensas utilizar varias etiquetas fluorescentes, es muy importante elegir diferentes picos de excitación y emisión. Si los picos de emisión se superponen, puede resultar difícil distinguir entre los dos fluoróforos.
Por lo general, desea etiquetar su proteína con la etiqueta fluorescente más brillante del espectro disponible, para poder obtener una señal clara y superar cualquier posible fluorescencia de fondo. El valor de brillo es el producto del coeficiente de extinción de la proteína y el rendimiento cuántico. Sin embargo, las cifras obtenidas pueden resultar difíciles de interpretar. Por lo tanto, un método de medición común es comparar el brillo de una etiqueta fluorescente con una etiqueta estándar como EGFP.
La maduración define el momento en el que una etiqueta fluorescente se pliega correctamente, forma un cromóforo y comienza a emitir fluorescencia. En los eventos urgentes en las células vivas, los tiempos de maduración cortos son importantes. Por ejemplo, SfGFP se puede plegar en 10 minutos, mientras que mOrange suele tardar 4 horas.
El blanqueamiento es una medida de la fotoestabilidad. Es decir, cuánto tiempo tarda el cromóforo en perder su capacidad de emitir luz tras ser excitado. Si va a realizar experimentos con un retardo prolongado, considere una etiqueta que sea altamente fotoestable. El zafiro T tiene una vida media de blanqueo de 25 segundos, mientras que el EGFP es mucho más estable, normalmente de 174 segundos.
Como la mayoría de las proteínas, las etiquetas fluorescentes se ven afectadas por el pH, la temperatura y los niveles de oxígeno. Dependiendo de los criterios que esté utilizando, es posible que deba seleccionar la etiqueta correcta.
El valor del pH afectará a los picos de excitación y emisión, y la mayoría de las etiquetas fluorescentes son sensibles a los ácidos. Algunos incluso pueden cambiar la intensidad de la fluorescencia cuando cambia el pH (por ejemplo, pHTomato). El valor de PKa es un buen indicador de la sensibilidad al pH.
Además, la temperatura y los niveles de oxígeno afectan el tiempo de maduración. La falta de oxígeno suele retrasar la maduración. Sin embargo, la nueva etiqueta fluorescente UnaG fluoresce incluso en condiciones de bajos niveles de oxígeno.
Dado que la mayoría de las etiquetas fluorescentes se derivan de proteínas de medusas o corales en lugar de células o tejidos de mamíferos, puede haber diferencias entre especies en los codones de aminoácidos utilizados, lo que puede resultar en niveles bajos de expresión y señales débiles.
Afortunadamente, muchas versiones nuevas de etiquetas fluorescentes han sido optimizadas con codones para una alta expresión en mamíferos. Entonces, antes de usarlo, debe confirmar si su secuencia se puede expresar en el sistema de destino.
Otro punto muy importante es determinar si tu etiqueta es un monómero o un dímero (los monómeros suelen estar representados por "m", como mCherry). Esto afectará sus experimentos. Muchas de las primeras etiquetas fluorescentes forman fácilmente oligómeros, lo que puede afectar la función de la proteína de fusión. Por ejemplo, EGFP es una etiqueta monomérica, pero en altas concentraciones puede formar dímeros que pueden alterar los orgánulos subcelulares o alterar experimentos como FRET.