Introducción a la tecnología de edición de genes CRISPR-Cas9
CRISPR-Cas9 es la tercera generación de tecnología de edición de genes después de la introducción de tecnologías de edición de genes como ZFN y TALEN. En tan solo unos años, la tecnología CRISPR-Cas9 se ha vuelto popular en todo el mundo y se ha vuelto popular. convertirse en una parte importante de la edición y modificación de genes existentes. Es una de las tecnologías más eficientes, simples, de menor costo y más fáciles de usar y se ha convertido en el sistema de edición de genes más común en la actualidad.
1. ¿Qué es el sistema CRISPR-Cas?
El sistema CRISPR-Cas es un sistema inmunológico natural de los procariotas. Después de ser invadidas por un virus, ciertas bacterias pueden almacenar un pequeño segmento del gen viral en un espacio de almacenamiento llamado CRISPR en su propio ADN. Cuando se vuelve a encontrar una invasión de virus, las bacterias pueden identificar el virus basándose en los fragmentos almacenados y cortar el ADN del virus para hacerlo ineficaz.
El sistema C RISPR-Cas consta de dos partes: locus CRISPR y gen Cas (gen asociado a CRISPR).
1. CRISPR (/'kr?sp?r/) es una secuencia repetitiva en el genoma de los procariotas. El nombre completo de CRISPR es Repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente intercaladas. Distribuido entre el 40% de las bacterias secuenciadas y el 90% de las arqueas secuenciadas. (Nota: al vivir en entornos extremos, como volcanes de aguas profundas, aguas termales terrestres y lagos salados y alcalinos, existen algunas bacterias con estructuras únicas llamadas arqueas)
La secuencia del gen CRISPR consiste principalmente en una Secuencia líder (se compone de líder), secuencia repetida (repetición) y secuencia espaciadora (espaciador).
① Secuencia líder: rica en bases AT, situada aguas arriba del gen CRISPR, y se considera promotora de la secuencia CRISPR.
② Secuencias repetidas: aproximadamente de 20 a 50 pb de longitud y que contienen secuencias palindrómicas de 5 a 7 pb. Las transcripciones pueden formar una estructura en horquilla y estabilizar la estructura secundaria general del ARN.
③ Secuencia espaciadora: Es una secuencia de ADN extraña capturada por las bacterias. Esto equivale a la "lista negra" del sistema inmunológico bacteriano. Cuando estos materiales genéticos extraños invadan nuevamente, el sistema CRISPR/Cas los atacará con precisión.
2. El gen Cas está ubicado cerca del gen CRISPR o disperso en otras partes del genoma. Las proteínas codificadas por este gen pueden interactuar con la región de la secuencia CRISPR. Por lo tanto, el gen se denominó gen asociado a CRISPR (asociado a CRISPR, Cas).
La proteína Cas codificada por el gen Cas es crucial en el proceso de defensa. Actualmente se han descubierto múltiples tipos de genes Cas como Cas1-Cas10.
Basándose en el papel de las proteínas Cas en el proceso de defensa inmune bacteriana, los sistemas CRISPR-Cas se dividen actualmente en dos grandes categorías.
La primera categoría: sus factores efectores para la escisión de ácidos nucleicos exógenos son complejos formados por múltiples proteínas Cas, incluidas las de tipo I, tipo III y tipo IV.
La segunda categoría: sus factores actuantes son proteínas Cas relativamente únicas, como la proteína Cas9 de tipo II y la proteína Cpf de tipo V.
Actualmente, el sistema CRISPR más utilizado es el sistema CRISPR-Cas tipo II, que es el sistema CRISPR-Cas9.
2. El principio de funcionamiento de CRISPR-Cas9
El mecanismo de funcionamiento de CRISPR-Cas9 se puede entender en tres etapas.
1. La primera etapa: Obtener la región espaciadora altamente variable de CRISPR (capturando ADN extraño y registrando la "lista negra")
La región espaciadora altamente variable de CRISPR Acquisition en realidad significa que una secuencia corta de ADN del fago invasor extraño o ADN plasmídico se integra en el genoma de la bacteria huésped. La posición de integración está entre las dos secuencias repetidas en el extremo 5' de CRRSPR. Por lo tanto, la disposición de las secuencias espaciadoras de 5' a 3' en el locus CRISPR también registra la secuencia temporal de invasión de material genético extraño.
La adquisición de nuevas secuencias espaciadoras se puede dividir en tres pasos:
Paso 1: Las proteínas codificadas por Cas1 y Cas2 escanearán el ADN invasor e identificarán la región PAM, y luego cerrar la La secuencia de ADN de PAM sirve como secuencia candidata a protoespaciador.
Paso 2: El complejo proteico Cas1/2 corta la secuencia protoespaciadora del ADN extraño y, con la ayuda de otras enzimas, inserta la secuencia protoespaciadora aguas abajo de la región líder adyacente a la secuencia CRISPR.
Paso 3: Se reparará el ADN para cerrar la brecha abierta de la doble cadena. De esta forma, se añade una nueva secuencia espaciadora a la secuencia CRISPR del genoma.
2. La segunda etapa: expresión del locus CRISPR (incluyendo la transcripción y el procesamiento de maduración postranscripcional)
La secuencia CRISPR se transcribe bajo el control de la región líder para producir pre -crRNA (precursor de crRNA)) y tracrRNA (crRNA transactivador) complementario a la secuencia de pre-crRNA también se transcribe. El pre-ARNcr forma ARN bicatenario con ARNtracr mediante emparejamiento de bases complementarias y se ensambla en un complejo con la proteína codificada por Cas9. Seleccionará el "número de tarjeta de identificación" correspondiente (ARN de secuencia espaciadora) según el tipo de intruso y, con la ayuda de la ribonucleasa III (RNasa III), cortará esta "tarjeta de identificación" para formar un ARNcr corto (contiene un solo tipo). de ARN de secuencia espaciadora y parte de la región de secuencia repetitiva).
crRNA, Cas9 y tracrRNA forman el complejo final para preparar el siguiente paso de corte.
3. La tercera etapa: la activación de la actividad del sistema CRISPR/Cas (interferencia dirigida)
El complejo final compuesto por crRNA, Cas9 y tracrRNA es como un misil guiado. realizar un ataque preciso al ADN del invasor. Este complejo escaneará toda la secuencia de ADN extraño e identificará secuencias protoespaciadoras que son complementarias al crRNA. En este momento, el complejo se localizará en la región de la secuencia PAM/protoespaciador y las dobles hebras de ADN se desenredarán para formar un R-Loop. El crRNA se hibridará con la cadena complementaria, mientras que la otra cadena permanecerá libre.
Posteriormente, el sitio preciso de escisión del extremo romo de la proteína Cas9 se localiza 3 nucleótidos aguas arriba de PAM, formando un producto de extremos romos. El dominio HNH de la proteína Cas9 es responsable de cortar la cadena de ADN complementaria al ARNcr, mientras que el dominio RuvC es responsable de cortar la otra cadena de ADN no complementaria. Finalmente, bajo la acción de Cas9, se producen roturas de doble cadena del ADN (DSB), se silencia la expresión del ADN extraño y los invasores son eliminados de un solo golpe.
3. Tecnología y aplicaciones de edición de genes CRISPR-Cas9...
tracrRNA-crRNA también puede desempeñar un papel en la guía de Cas9 cuando se fusiona en un ARN guía monocatenario (sgRNA) .
La tecnología de edición de genes CRISPR-Cas9 utiliza sgRNA (ARN guía) diseñado artificialmente para identificar la secuencia del genoma objetivo y guiar a la proteasa Cas9 para cortar eficazmente las dobles hebras de ADN, formando roturas de doble hebra que provocarán la reparación después del daño. La eliminación o activación de genes, etc., en última instancia logran el propósito de modificar el ADN genómico.
Amplia aplicación de CRISPR-Cas9
1. Eliminación genética (Knock-out)
Cas9 puede cortar el genoma objetivo para formar ADN doble. La cadena se rompe. . En circunstancias normales, las células utilizan uniones de extremos no homólogos (NHEJ) altamente eficientes para reparar el ADN roto. Sin embargo, durante el proceso de reparación, generalmente ocurre una falta de coincidencia en la inserción o eliminación de bases, lo que resulta en una mutación por desplazamiento de marco (mutación por desplazamiento de marco: se refiere al cambio en el marco de lectura de la molécula de ADN debido a la eliminación o inserción de una base en un sitio determinado. , lo que resulta en una serie de cambios de código posteriores que cambian el gen que originalmente codificaba una determinada cadena peptídica en una secuencia de cadena peptídica completamente diferente, lo que hace que el gen objetivo pierda su función, logrando así la eliminación del gen. Para mejorar la especificidad del sistema CRISPR, se puede mutar un dominio de Cas9 para formar una nickasa nucleasa Cas9 que solo puede cortar hebras individuales de ADN para crear mellas en el ADN. Por lo tanto, si desea crear un efecto de rotura de doble cadena, puede diseñar dos secuencias de sgRNA para apuntar a las dos hebras complementarias de ADN respectivamente. De esta manera, los dos sgRNA se unen específicamente a la secuencia objetivo para formar una rotura de ADN. El ADN se romperá a través de la migración durante el proceso de reparación. Mutación del código para lograr la desactivación genética
2. Activación genética (Knock-in)
Cuando la doble hebra del ADN se rompe, Si una plantilla de reparación de ADN ingresa a la célula, la parte rota del genoma se realiza mediante reparación por recombinación homóloga (HDR) basándose en la plantilla de reparación para lograr la activación del gen.
La plantilla de reparación consta del gen diana que se va a importar y las secuencias de homología (brazos de homología) aguas arriba y aguas abajo de la secuencia objetivo. La longitud y la posición de los brazos de homología están determinadas por el tamaño de la secuencia de edición. Las plantillas de reparación de ADN pueden ser cadenas de desoxinucleótidos lineales/bicatenarios o plásmidos de ADN bicatenario. El modo de reparación HDR ocurre a baja frecuencia en las células, generalmente menos del 10%. Para aumentar la tasa de éxito de la activación de genes, muchos científicos están trabajando actualmente para mejorar la eficiencia de HDR, sincronizar las células editadas con el período de división celular más activo de HDR y promover el método de reparación para continuar con HDR o usar; métodos químicos para inhibir genes de NHEJ para mejorar la eficiencia de HDR
3. Supresión genética, activación genética (represión o activación)
La característica de Cas9 es que puede unirse y cortar de forma independiente el gen objetivo, y las dos funciones de Cas9 se pueden modificar mediante mutaciones puntuales. Los dos dominios RuvC- y HNH- están inactivos, y el dCas9 formado solo puede unirse a genes objetivo bajo la mediación de sgRNA, pero no tiene la función de. cortando el ADN. Por lo tanto, la unión de dCas9 al sitio de inicio de la transcripción de un gen puede bloquear el inicio de la transcripción, inhibiendo así la expresión génica; la unión de dCas9 a la región promotora de un gen también puede combinarse con inhibidores/activadores de la transcripción para inhibir la transcripción de genes diana posteriores. Inhibir o activar. Por tanto, la diferencia entre dCas9 y Cas9 y Cas9 nickasa es que la activación o inhibición provocada por dCas9 es reversible y no provoca cambios permanentes en el ADN genómico.
4. Edición Multiplex
Al transferir múltiples plásmidos de sgRNA a las células, se pueden editar múltiples genes al mismo tiempo, lo que tiene la función de detectar funciones del genoma. Las aplicaciones de la edición multiplex incluyen el uso de Cas9nickases duales para mejorar la precisión de la eliminación de genes, las eliminaciones del genoma a gran escala y la edición de diferentes genes simultáneamente. Normalmente, se pueden construir de 2 a 7 sgRNA diferentes en un plásmido para la edición múltiple de genes CRISPR.
5. Cribado del genoma funcional
El uso de CRISPR-Cas9 para la edición de genes puede producir una gran cantidad de células genéticas mutantes. Por lo tanto, estas células mutantes se pueden utilizar para confirmar si los cambios fenotípicos. son causadas por genes o causadas por factores genéticos. El método tradicional para la detección del genoma es la tecnología de shRNA, pero el shRNA tiene sus limitaciones: tiene altos efectos fuera del objetivo y no puede inhibir todos los genes, lo que genera resultados falsos negativos. La función de detección del genoma del sistema CRISRP-Cas9 tiene las ventajas de una alta especificidad e irreversibilidad, y se ha utilizado ampliamente en la detección del genoma. En la actualidad, la función de detección del genoma de CRISPR se utiliza para detectar genes relacionados que regulan fenotipos, como genes que inhiben la producción de medicamentos de quimioterapia o toxinas, genes que afectan la migración de tumores y la construcción de bibliotecas de detección de virus para la detección a gran escala. de genes potenciales.