¿Pasos occidentales?

1) Según las instrucciones del fabricante, monte la placa sándwich de vidrio en el dispositivo de electroforesis con dos piezas de vidrio limpio, una placa plana y un espaciador de 0,75 mm, y fíjela en el soporte lleno de pegamento.

2) Preparar el gel líquido de separación según la Tabla 7.1 y desgasificar, luego añadir persulfato de amonio al 10% y TEMED, agitar suavemente y mezclar.

Tabla 7.1 Preparación de gel de separación de poliacrilamida

Reactivos necesarios para preparar geles de separación de diferentes concentraciones (ml)

5% 8% 10% 12 % 15%

Acry:Bis (30:0,8) 2,50 4,00 5,00 6,00 7,50

4×Tris·Cl/SDS, pH 8,8 3,75 3,75 3,75 3,75 3,75

H2O 8,75 7,25 6,25 5,25 3,75

Persulfato de amonio al 10% 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05

TEMED 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01

Separar según sea necesario Seleccionar el porcentaje de acrilamida adecuado concentración según el tamaño de las moléculas de proteína. Generalmente, se puede usar gel al 5% para separar moléculas de proteína desnaturalizada con SDS de 60-200 kDa, se usa 10% para 16-70 kDa y 15% para 12-45 kDa.

3) Utilice una pipeta Pasteur para añadir inmediatamente el líquido del gel de separación en el sándwich de placa de vidrio a lo largo del borde de una junta en el sándwich hasta que el gel tenga aproximadamente 5 cm de altura. Si el volumen de la muestra es inferior a 10 μl, no es necesario verter gel laminado.

4) Usando otra pipeta Pasteur, agregue lentamente una capa de alcohol isobutílico saturado con agua (aproximadamente espesa) desde la junta de un lado y luego desde la junta del otro lado hasta la parte superior del líquido. superficie de la capa intermedia. Dejar polimerizar el gel a temperatura ambiente durante 30 min.

Después de la polimerización, se puede ver que hay una línea refractiva clara entre la capa superior de isobutanol y la interfaz del gel. El problema de la falla de polimerización del pegamento a menudo se debe al persulfato o TEMED, o ambos. .

5) Vierta el isobutanol en la capa superior, enjuague la superficie superior del gel con 1 × Tris-Cl/SDS, tampón pH 8,8 y séquelo con papel absorbente tanto como sea posible. .

6) Prepare el pegamento líquido para laminación según la Tabla 7.2 y use una pajita para agregar el líquido al sándwich de placa de vidrio a lo largo de una junta hasta que llegue a la parte superior del sándwich.

Tabla 7.2 Preparación del pegamento laminado de poliacrilamida

GEL% (3,9%) Total (10,05ml)

Acry:Bis(30:0,8) 1,30 ml

4×Tris·Cl/SDS, pH6,8 2,50 ml

H2O 6,10 ml

Persulfato de amonio 10% 0,05 ml

TEMED 0,01 ml

7) Inserte un peine de 0,75 mm de grosor en el pegamento líquido para laminar en la capa intermedia. Si es necesario, agregue líquido pegamento para laminar para llenar el espacio restante. Deje que el pegamento para laminar polimerice a temperatura ambiente durante 30 minutos.

8) En un tubo de microcentrífuga con tapón de rosca, diluya la muestra de proteína a analizar 1:1 (v/v) con 2×SDS tampón de carga y hierva a 100°C durante 5-10 minutos. . Si la muestra es un precipitado de proteínas, agregue de 50 a 100 µl de tampón de carga 1x SDS para disolverlo y hiérvalo a 100 °C durante 5 a 10 minutos. Disuelva la mezcla estándar de peso molecular de proteínas en 2 × tampón de carga SDS según las instrucciones del proveedor.

Para un orificio de muestra de 0,3 cm de ancho, se recomienda que el volumen de muestra no supere los 20 μl. Para la tinción con azul brillante de Coomassie, se deben agregar de 25 a 50 μg de una mezcla de proteínas con componentes complejos, mientras que si solo hay una o algunas proteínas en la muestra, solo se necesitan de 1 a 10 μg de proteína. Cuando se utiliza tinción con plata, la cantidad de muestra se puede reducir de 10 a 100 veces (se pueden disolver de 0,01 a 0,5 ng de muestra de proteína en un volumen de menos de 20 μl, dependiendo de la complejidad de la muestra).

Preparación de tampón de carga 2×SDS:

Volumen componente (ml)

Tris·Cl 0,5M (pH6,8) 12,5

20%SDS 11,5

Glicerina 10

2% Azul-Bromo-fenol 2,5

β-mercaptoetanol* 5,0

Añadir H2O hasta un volumen total de 50 ml y alícuota

*β-mercaptoetanol Añadir justo antes de su uso.

9) Saque el peine con cuidado para evitar rasgar el orificio de inyección del gel de poliacrilamida. Después de sacar el peine, enjuague los pocillos con 1 × tampón de electroforesis SDS y llénelos con este tampón.

10) Fije la placa de gel a la cámara tampón superior (tanque superior) del dispositivo de electroforesis según las instrucciones del fabricante y, al mismo tiempo, agregue la cantidad recomendada de tampón de electroforesis 1×SDS a la inferior. cámara de amortiguamiento (tanque inferior) .

11) Coloque la placa de gel fijada en el tanque superior en el tanque inferior y agregue parte del tampón de electroforesis al tanque superior para cubrir apenas el orificio de carga del gel.

12) Utilice una jeringa de 50 μl con una aguja de boca plana para agregar volúmenes iguales de muestras de proteína de la misma concentración en los pocillos de muestra. Agregue con cuidado la muestra para que forme una capa delgada en el fondo. de los pocillos. Agregue estándares de peso molecular de proteínas a los pocillos de control. Para las muestras, si hay un pocillo de muestreo vacío, se debe agregar un volumen igual de tampón de muestra 1xSDS en blanco para evitar la difusión de muestras de los carriles adyacentes.

13) Agregue el tampón de electroforesis 1×SDS restante al tanque superior. Haga esto lenta y cuidadosamente para evitar eliminar la muestra del pozo de muestra.

14) Conecte la fuente de alimentación para electroforesis en placa vertical de 0,75 mm de espesor, primero realice la electroforesis a 60 V hasta que el tinte azul de bromofenol entre en el gel de separación del gel de apilamiento, luego ajuste el voltaje a 120 V y continúe la electroforesis hasta. el colorante azul de bromofenol ingresa al gel de separación hasta que el azul llega al fondo del gel.

15) Apague la alimentación, retire los cables conectados y deseche el tampón de electroforesis. Retirar el sándwich de gel junto con la cubeta superior.

16) Coloque el gel de manera que se pueda identificar el orden de adición, desenganche la placa de gel del recipiente superior y colóquela sobre una pila de papel absorbente o toallas de papel.

17) Retire con cuidado la mitad de la junta de sellado de bordes y utilícela como palanca para levantar la placa de vidrio superior y exponer el gel.

18) Retire con cuidado el gel de la placa de vidrio que se encuentra debajo y corte un pequeño trozo en una esquina del gel para que aún se pueda reconocer el orden de carga después de teñir y secar el gel. análisis de proteínas.

19) Transferencia de membrana

Conectar la superficie del gel al electrodo negativo y la membrana de nitrocelulosa al electrodo positivo. (100 V, 1 hora) debe colocarse a 4 ℃.

20) Limpieza

Coloque la membrana de nitrocelulosa en 1X TBST y límpiela 3 veces durante 5 minutos cada vez. La coctelera tiembla.

21), bloqueo

22), incubación del anticuerpo primario

El anticuerpo primario se diluye con TBST1:1000 y se coloca en él la membrana de nitrocelulosa, 37 ℃ Incubar durante 1,5 horas (o toda la noche a 4 ° C) agitando en una coctelera.

23) Limpieza

Coloque la membrana de nitrocelulosa en 1X TBST y límpiela 3 veces durante 5 minutos cada vez.

24), incubación del anticuerpo secundario

Diluir el anticuerpo secundario con TBST 1:8000, colocarle la membrana de nitrocelulosa e incubar a 37°C durante 1 hora con agitación en una criba vibradora.

25), limpieza

Igual que 22. Luego, lave 2 veces con 1X TBS durante 5 minutos cada vez para eliminar el Tween 20 de la membrana, ya que puede dificultar la Deposición de materia en el fondo.

26), desarrollo del color

Preparar la solución de revelado del color según la siguiente fórmula:

1mL de agua + 1 gota (unos 50 microlitros) de reactivo A (luego mezcle (uniformemente) + 1 gota de reactivo B + 1 gota de reactivo C

Coloque la membrana de nitrocelulosa e incúbela. Una vez que se desarrolle el color, póngala inmediatamente en agua desionizada para detener la reacción. .