Introducción a la ADN polimerasa Taq
2 Nota La ADN polimerasa Taq se aísla del hongo termófilo yT 1. YT es un hongo termófilo que puede crecer a 70 ~ 75°C. Fue aislado de las aguas termales volcánicas del Bosque Nacional de Yellowstone en Estados Unidos en 1969. La longitud total del gen de la enzima es de 2496 bases, codifica 832 aminoácidos, y la molécula de proteína de la enzima es de 94 KDa. Su actividad específica es de 200.000 unidades/mg. A 75 ~ 80°C, cada molécula de enzima puede extenderse alrededor de 150 nucleótidos por segundo, y a 70°C, puede extenderse más de 60 nucleótidos por segundo. A 55°C, es de 24 nucleótidos/segundo. Una temperatura demasiado alta (superior a 90 °C) o demasiado baja (22 °C) afectará la actividad de la ADN polimerasa Taq. Aunque casi no hay síntesis de ADN por encima de 90°C, la enzima tiene buena estabilidad térmica y puede mantener una alta actividad en las condiciones de alta temperatura de los ciclos de PCR. A 92,5 ℃, 95 ℃ y 97,5 ℃, la ADN polimerasa Taq en la mezcla de PCR aún puede mantener una actividad del 50 % después de 65438 ± 0,30 min, 40 min y 5 ~ 6 min respectivamente. Los experimentos muestran que la temperatura de desnaturalización de la reacción de PCR es de 95 °C ~ 20 segundos. Después de 50 ciclos, la ADN polimerasa Taq todavía tiene un 65 % de actividad. La estabilidad térmica de la ADN polimerasa Taq es un requisito previo para su aplicación en reacciones de PCR. Ésta es también la razón del rápido desarrollo y la aplicación generalizada de la PCR. La ADN polimerasa Taq también tiene actividad de transcripción inversa, similar a la transcriptasa inversa. La temperatura de esta actividad es generalmente de 65 a 68 °C. En presencia de Mn2, su actividad de transcripción inversa es mayor.
La TaqDNA polimerasa es una enzima que depende del Mg2, y su actividad catalítica es muy sensible a la concentración de Mg2. Cuando la concentración de dNTP es de 0,7 ~ 0,8 mmol/L, la reacción de PCR se lleva a cabo con diferentes concentraciones de Mg2 durante 10 minutos. Los resultados muestran que cuando la concentración de Mgcl2 es de 2,0 mmol/L, la actividad catalítica de la enzima es la. más alta, y esta concentración puede maximizar la activación de la actividad de la ADN polimerasa Taq. Cuando la concentración de Mg2 es demasiado alta, inhibirá la actividad de la ADN polimerasa Taq. Cuando la concentración de Mgcl2 es de 10 mmol/L, porque el Mg2 se puede combinar con dNTP. afectará la concentración de Mg2 libre en la solución de reacción de PCR, por lo que en diferentes sistemas de reacción, la concentración de Mgcl2 debe ajustarse adecuadamente. Optimizar la concentración. En términos generales, la concentración de Mg2 debe ser al menos 0,5 ~ 1,0 mmol/L mayor que la concentración total de dNTP. Una concentración adecuada de KCL puede aumentar la actividad catalítica de la ADN polimerasa Taq en un 50-60 %, y la concentración óptima es 50 mmol/L. Cuando la concentración de KCL es superior a 75 mmol/L, la actividad de la ADN polimerasa Taq se inhibe significativamente.