Instrucciones de uso del kit de síntesis de ADNc de PCR inteligente

Respuesta: La tecnología de síntesis de ADNc SMARTTM utiliza ARN total o ARN Poly A+ como plantilla, oligonucleótido (dT) modificado como cebador y sintetiza la primera hebra bajo la catálisis de la transcriptasa inversa MMLV. Cuando la transcriptasa inversa alcanza el extremo 5' del ARNm, la actividad transferasa terminal de la transcriptasa inversa agregará de 3 a 5 ácidos desoxicitidílicos al extremo 3' de la primera cadena de ADNc. El extremo 3' del oligonucleótido inteligente contiene un residuo de guanilato extendido que se hibrida con citidilato enriquecido para formar una plantilla extendida. Luego se usa la transcriptasa inversa para convertir la plantilla y el oligonucleótido inteligente se usa como plantilla para continuar con la extensión. El ADNc monocatenario sintetizado de esta manera tiene una secuencia complementaria al oligonucleótido SMART en el extremo 3' y una secuencia complementaria al cebador oligo(dT) en el extremo 5'. Estas secuencias se utilizan como sitios de síntesis de cebadores para la siguiente PCR a larga distancia. Como resultado, se obtuvo un ADNc bicatenario rico en secuencias de longitud completa.

P: ¿Cuáles son las diferencias entre los productos de la serie smart suite?

Respuesta: El kit de construcción de bibliotecas de cdna inteligente se utiliza para construir bibliotecas de cDNA de alta calidad a partir de pequeñas cantidades de muestras de ARN. El kit incluye síntesis inteligente de ADNc y construcción de bibliotecas. TriplEx2 o vector donante creador pDNR-LIB. ¿Porque el kit está diseñado específicamente para la construcción de bibliotecas, similar a Clontech? ¿Elección de PCR? Los kits de hibridación sustractiva de CDNA no se pueden utilizar juntos.

¿Se puede utilizar el kit de síntesis de ADNc por PCR inteligente con Clontech? ¿Elección de PCR? Se utiliza junto con la tecnología de sustracción de ADNc. El ARN total no se puede utilizar directamente para experimentos de resta, pero el kit de síntesis de ADNc SMART PCR se puede utilizar para amplificar ADNc de alta calidad para experimentos de hibridación. Asimismo, se pueden amplificar pequeñas cantidades de ARN Poly A+ con el kit de síntesis de ADNc SMART PCR. El ADNc inteligente también se puede utilizar para reemplazar la hibridación Northern estándar sin tener que realizar una hibridación Northern virtual cuando solo se tienen muestras de ARN limitadas. El kit de síntesis de ADNc SMART PCR contiene oligonucleótidos SMART ⅱ y cebadores de síntesis de ADNc, los cuales tienen secuencias que hacen que Clontech? PCR-Select resta el sitio Rsaⅰⅰ deseado. Este kit también se puede utilizar para construir bibliotecas de ADNc SMART en otros vectores de su elección.

El kit de amplificación de ADNc SMART RACE combina la tecnología de síntesis de ADNc SMART y el método RACE. La ventaja de este kit es que puede construir ADNc de longitud completa, no requiere ligadura de adaptador, tiene alta sensibilidad y su método es simple.

P: ¿Se puede utilizar la tecnología inteligente para la amplificación rápida de los extremos del ADNc (RACE)?

Respuesta: Sí. Con el perfeccionamiento del nuevo kit de amplificación de ADNc SMART RACE, todas las ventajas de la tecnología SMART se pueden utilizar en los protocolos RACE.

P: ¿Por qué existe un cierto límite en el número de ciclos de PCR durante la síntesis inteligente de ADNc?

Respuesta: Una característica única de la tecnología de ADNc inteligente es el paso de amplificación por PCR a larga distancia. Para mantener la expresión génica del ADNc SMART, es necesario realizar la menor cantidad de ciclos posible. Si el número de ciclos es demasiado alto y la amplificación excede la etapa de crecimiento exponencial, el ssDNA se acumulará, haciéndolo inadecuado para operaciones de cDNA en etapa tardía, como la clonación o la resta. Además, cuanto mayor es el número de ciclos, mayor es la probabilidad de error de la polimerasa termoestable y menor es la fidelidad de la PCR. Por lo tanto, para obtener ADNc de alta calidad, es muy importante mantener el número de ciclos dentro de los parámetros aprobados.

P: ¿Cuáles son las características de la biblioteca SMARTTM?

Respuesta: La biblioteca de ADNc inteligente contiene abundante ADNc de longitud completa. El tamaño medio de las inserciones es de 1,5 a 2 Kb. El inserto más grande que clonamos de la biblioteca SMART fue un ADNc de β-miosina de más de 6 kb. Incluso si el material de partida es ARN total, rara vez se analiza el ARN ribosómico. Los resultados experimentales mostraron que 50 clones de la biblioteca de ADNc SMART no mostraban clones de ARN ribosómico. Las bibliotecas de ADNc SMART construidas con 50 ng de ARN total o 25 ng de ARN poli A+ tenían una fidelidad genética similar a las bibliotecas construidas con 5 ug de ARN poli A+ mediante el método estándar de Gubler y Hoffman.

P: ¿Por qué no hay una secuencia de ARNr en el ADNc amplificado por SMARTTM PCR?

Respuesta: Aunque el ARNr se puede transcribir de forma inversa durante la síntesis del ADNc de primera cadena SMART, estas secuencias no se amplificarán en el proceso de PCR posterior. Esto se debe a que, en la mayoría de los casos, la secuencia de ARNr se transcribe de forma inversa por autodirección, por lo que el fragmento de ADNc final no tiene secuencias específicas de SMART 5' y 3' y no puede amplificarse mediante PCR exponencial.

P: ¿Cuál es la cantidad mínima de ARN que se puede utilizar como plantilla para la amplificación del ADNc por SMART PCR?

Respuesta: Aunque podemos utilizar la tecnología SMART para construir bibliotecas a partir de 10 ng de ARN total, recomendamos que el material de partida sea al menos 50 ng de ARN total o 25 ng de Polya+RNA. Esto garantiza que el conjunto de ADNc SMART tenga una mayor calidad y una representación genética más fuerte.

P: ¿Puedo cambiar la secuencia de los oligonucleótidos SMARTTM?

Respuesta: Cualquier cambio en la secuencia de oligonucleótidos afectará la eficiencia de la síntesis y amplificación del ADNc. Smart ⅱ y smart ⅳ son raros.

La secuencia y diseño de los glucósidos están protegidos mediante patentes.

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