Proceso de replicación del ADN
Explica brevemente el proceso de replicación del ADN de los procariotas.
1. Desenrollado de la doble hélice del ADN
Durante el proceso de replicación del ADN, el ADN bicatenario primero se desenrolla para formar una horquilla de replicación, y la formación de una horquilla de replicación es un Proceso de replicación complejo, que involucra una variedad de proteínas y enzimas.
(1) Proteína de unión al ADN monocatenaria (proteína del ADN SSB).
La proteína SsbDNA es una proteína que se une fuertemente al ADN monocatenario. La proteína ssbDNA procariótica muestra un efecto sinérgico cuando se une al ADN: si la capacidad de unión de la primera proteína ssbDNA y el ADN es 1, la capacidad de unión de la segunda proteína SSB DNA puede alcanzar 103, la proteína SsbDNA en células eucariotas no tiene; los efectos anteriores cuando se combinan con ADN monocatenario. La función de la proteína ssbDNA es garantizar que la hebra única desenrollada por la helicasa mantenga su estructura monocatenaria hasta que se complete la replicación. Existe como tetrámero en horquillas de replicación y se elimina y recicla después de la replicación monocatenaria. Por lo tanto, la proteína ssbDNA solo mantiene la existencia de una única hebra y no tiene ningún efecto de desenrollado.
(2)ADN helicasa
La ADN helicasa puede obtener energía hidrolizando ATP para desenrollar el ADN bicatenario. La actividad de esta helicasa para descomponer el ATP depende de la presencia de ADN monocatenario. Si hay extremos monocatenarios o espacios en el ADN bicatenario, la ADN helicasa puede unirse primero a esta parte y luego moverse gradualmente hacia la dirección bicatenaria. Durante la replicación, la mayoría de las helicasas de ADN pueden moverse a lo largo de la dirección 5'-->3' de la plantilla retrasada y, a medida que avanza la bifurcación de replicación, solo unas pocas helicasas (proteínas Rep) se mueven a lo largo de la dirección 3'-->5'. . Por lo tanto, se especula que la proteína Rep y la ADN helicasa específica cooperan para desenrollar el ADN bicatenario en las dos hebras originales del ADN.
(3) Proceso de desenrollado del ADN
El ADN no es sólo una doble hélice sino también un estado superenrollado antes de la replicación. La existencia del estado superenrollado es un estado estructural necesario antes de desenrollarse. Además de la helicasa, también hay algunas proteínas específicas, como las proteínas del ADN en E. coli. Una vez que se desagrega parte del ADN bicatenario, debe haber una proteína ssbDNA para estabilizar el ADN monocatenario desagregado y garantizar que esta parte. no volverá a la cadena de ADN bicatenario. El proceso de iniciación de la replicación de dos ADN monocatenario es diferente, pero tanto la cadena principal como la siguiente requieren cebadores de ARN para iniciar la síntesis de la subcadena de ADN. Por lo tanto, la diferencia entre la cadena principal y la siguiente es que la primera continúa sintetizando 5'-3' desde el origen de replicación sin formar fragmentos de Okazaki, mientras que la segunda sintetiza continuamente fragmentos de Okazaki de aproximadamente 2-3 KB de longitud con la cadena siguiente. aparición de la bifurcación de replicación.
2. Fragmento de Okazaki y replicación semidiscontinua
Debido a que las dos hebras de ADN son antiparalelas, un trozo de ADN desenredado cerca de la horquilla de replicación está en 5'--> 3 ', la otra es la dirección 3'--> 5', las polaridades de las dos plantillas son diferentes. La dirección de síntesis de todas las ADN polimerasas conocidas es la dirección 5'-->3', no la dirección 3'-->5', por lo que no puede explicar la replicación simultánea de dos ADN. Para explicar el fenómeno de replicación isocinética de cada subunidad de síntesis de plantilla de las dos cadenas de ADN, el académico japonés Okazaki et al propusieron un modelo de replicación semidiscontinua del ADN. En 1968, Okazaki marcó E. coli con 3H desoxitimidina durante un breve periodo de tiempo, extrajo el ADN y, tras la desnaturalización, lo ultracentrifugó para obtener muchos ADN marcados con 3H, llamados fragmentos de Okazaki. Después de extender el tiempo de marcaje, los fragmentos de Okazaki pueden convertirse en cadenas de ADN maduras, por lo que estos fragmentos deben ser productos intermedios durante el proceso de replicación. Otro experimento también demostró que durante el proceso de replicación del ADN, primero se sintetizaron fragmentos más pequeños, es decir, se probó un mutante de ADN ligasa sensible a la temperatura y se acumuló una gran cantidad de pequeños fragmentos de ADN a la temperatura donde la ligasa no funcionaba. , lo que indica que durante el proceso de replicación del ADN, al menos una cadena sintetiza primero fragmentos más cortos y luego la cadena de ligasa se convierte en un ADN macromolecular. En general, los fragmentos de Okazaki son más largos en procariotas que en eucariotas. Investigaciones en profundidad también han demostrado que la replicación continua de la cadena principal y la replicación discontinua de la cadena rezagada son omnipresentes en biología, por lo que se denominan replicación semidiscontinua de la doble hélice del ADN.
3. Inicio y terminación de la replicación
Toda replicación del ADN comienza desde un punto de partida fijo. La ADN polimerasa sólo puede extender la cadena de ADN existente, pero no comenzar desde cero. . ¿Cómo se forman nuevas copias de ADN? Una gran cantidad de estudios experimentales han demostrado que durante la replicación del ADN, la ARN polimerasa generalmente sintetiza un cebador de ARN en la plantilla de ADN y luego la polimerasa sintetiza una nueva cadena de ADN a partir del extremo 3 'del cebador de ARN. Para la cadena principal, este proceso de iniciación es relativamente sencillo. Siempre que exista un cebador de ARN, se puede sintetizar ADN polimerasa a partir de él. Para la cadena inferior, el proceso de iniciación es más complejo y requiere múltiples proteínas y enzimas. El proceso de iniciación de cadenas posteriores lo completa el iniciador. El iniciador está compuesto por seis proteínas, y el preiniciador o precursor une estas seis proteínas y luego se ensambla con la iniciasa o enzima procesadora de cebadores para formar el iniciador. Como una locomotora, el iniciador viaja en la dirección de la bifurcación de la hebra, provocando intermitentemente la generación de hebras cortas de ARN cebador con hebras rezagadas en la plantilla y luego sintetiza ADN bajo la acción de la ADN polimerasa III hasta que encuentra los siguientes cebadores u Okazaki. fragmentos.
El cebador de ARN se degrada mediante la ARNasa H, la ADN polimerasa I llena el espacio y luego cada dos fragmentos de Okazaki se unen mediante la ADN ligasa para formar una molécula de ADN grande.
(4) Telómeros y telomerasa
En 1941, el indio americano McClintock propuso la hipótesis de los telómeros, creyendo que debe haber una estructura especial al final de los cromosomas: los telómeros. Actualmente se sabe que los telómeros cromosómicos tienen al menos dos funciones: ① proteger los extremos de los cromosomas contra daños y mantener la estabilidad cromosómica; ② conectarse a la capa de fibras nucleares para permitir el posicionamiento de los cromosomas.
Después de comprender el proceso de replicación del ADN, los científicos se preguntaron cómo se llenaba el vacío después de que se eliminaba el cebador de ARN en el extremo 5' de la nueva cadena durante la replicación del ADN en la década de 1970. Si no se completa, el ADN se acortará cada vez que se copie. Por ejemplo, cuando se elimina el cebador de ARN, los fragmentos de Okazaki se rellenan con ADN sintetizado por la ADN polimerasa I y luego se ligan en una cadena completa mediante la ADN ligasa. Cuando la ADN polimerasa I cataliza la síntesis de ADN, requiere 3'-OH libre como cebador. El 5' de la cadena hija restante no se puede llenar, por lo que el cromosoma es un poco más corto.
En las células somáticas normales, es común que los telómeros se acorten una vez que se replican las enzimas cromosómicas. Se especula que una vez que los telómeros se acortan hasta un cierto umbral de longitud, hacen sonar una alarma e indican que la célula entre en senescencia, tal vez cuando las células juzgan que sus cromosomas se han vuelto demasiado cortos, la división se detiene, lo que resulta en un cierto límite en la vida normal; límite de células somáticas. Sin embargo, en las células cancerosas, los telómeros de los cromosomas mantienen una cierta longitud. ¿Por qué? Esto se debe a que después de replicar el ADN, la porción corta del extremo del cromosoma se complementa con telomerasa, una enzima que contiene ARN y que resuelve los problemas tanto de la plantilla como del cebador. Se detectó actividad telomerasa en las células germinales y en el 85% de las células cancerosas, pero no en las células somáticas normales. A mediados de la década de 1990, Blackburn clonó por primera vez el gen de la telomerasa en protozoos.
La telomerasa está activa en las células cancerosas. No solo permite que las células cancerosas continúen dividiéndose y proliferando, sino que también proporciona tiempo para que las células precancerosas o las células que se han vuelto cancerosas acumulen mutaciones adicionales, lo que es equivalente. a aumentar el número de mutaciones su capacidad para replicarse, invadir y, en última instancia, metastatizar. Al mismo tiempo, se desarrollaron fármacos dirigidos a los telómeros, tratando el cáncer inhibiendo la actividad de la telomerasa en las células cancerosas.
En cuanto a las características estructurales de los extremos del ADN de las células eucariotas, ya en 1978, Blackburn tomó como ejemplo la aparición de cuatro membranas del protozoo (un tipo de ciliado): ① un anillo en forma de horquilla en zigzag, ② compuesto únicamente; de Una secuencia simple compuesta de C y A repetidas (C4 A2) 20 ~ 70; ③ Hay muchas muescas en la cadena.