principio de secuenciación de Illumina
La celda de flujo es un control deslizante de vidrio con una celda de flujo, que es el portador de la reacción de secuenciación. Tiene 8 carriles.
El carril es el carril paralelo de la reacción de secuenciación, donde se producen la adición de reactivos, la elución y otros procesos.
La unidad más pequeña en cada carril se llama mosaico. Cada mosaico plantará diferentes grupos. Cada mosaico tomará fotografías 4 veces en un ciclo (una para cada base).
El resultado de la secuenciación se denomina lectura. Para la secuenciación de extremos emparejados, las lecturas del extremo 5' se denominan lecturas1 y las lecturas del extremo 3' se denominan lecturas2.
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La preparación de muestras consiste en añadir adaptadores a los extremos de los fragmentos de ADN. Las ondas ultrasónicas rompen las moléculas de ADN en fragmentos de secuencia larga de 300 a 800 pb (el genoma humano se divide en 300 a 500 pb), usan enzimas para llenarlo en extremos romos y luego agregan una base A al extremo 3' (porque hay una protuberancia en el extremo 3' del adaptador) T), luego agregue adaptadores emparejados complementarios en ambos extremos y luego amplifique mediante PCR para alcanzar una cierta concentración para formar una biblioteca de ADN monocatenario.
Cada carril tiene dos oligos (cebadores oligonucleotídicos) diferentes fijados (perpendiculares al carril). Durante la secuenciación, uno de los dos oligos es complementario al adaptador del fragmento, como se muestra en la imagen:
A continuación, se desnaturalizan las moléculas de doble cadena, se lava la plantilla original (izquierda) y se amplifica la cadena derecha mediante PCR puente. Posteriormente, se amplifica continuamente para generar millones de grupos, como se muestra a continuación:
La secuenciación comienza desde la extensión del primer cebador de secuenciación para generar la primera lectura. Cada nucleótido está marcado con fluorescencia. Cuatro nucleótidos llevan cuatro etiquetas fluorescentes diferentes, que emiten señales fluorescentes características. Este proceso patentado se denomina secuenciación por síntesis. Una vez completado el ciclo, el producto de lectura generado se elimina y se genera la siguiente lectura. Todo el proceso genera millones de lecturas, que representan todos los fragmentos.
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El punto 21 de este video habla sobre el proceso de secuenciación de extremos emparejados. En el proceso de escritura, no mencioné cómo se genera la segunda hebra. .
El archivo generado después de la secuenciación está en formato fastq y cada 4 líneas contiene una lectura. La primera línea de lectura: el lado izquierdo del espacio (comenzando desde el 1 rojo) es la información de identificación, DJG8. .... es la información del secuenciador. Los siguientes números representan la ejecución número 272 del secuenciador. El lado derecho del espacio es la información del código de barras, que se utiliza para distinguir muestras. La segunda línea es la información de secuencia de los resultados de la secuenciación. La cuarta línea es el valor de calidad base.