¿Qué tipos de marcadores moleculares de ADN existen y cuáles son sus características?
1 RFLP: esta tecnología fue fundada por Grodzicker en 1974. Una vez que el ADN genómico de un tipo biológico específico es completamente digerido por una determinada enzima de restricción, se producirán fragmentos de alelos homólogos de diferentes pesos moleculares. En otras palabras, el principio básico de la tecnología de etiquetado RFLP es detectar cualquier sitio que pueda causar hidrólisis enzimática. mediante separación electroforética. Por ejemplo, las mutaciones puntuales (generación y eliminación de sitios de escisión de enzimas) y la recombinación de un tramo de ADN (como cambios en la longitud entre los sitios de escisión de enzimas causados por inserciones y deleciones) pueden provocar cambios en el alelo de escisión de la enzima, produciendo así RFLP. . La tecnología incluye los siguientes pasos básicos: extracción de ADN; digestión con enzimas de restricción de ADN; separación de fragmentos de restricción mediante electroforesis en gel; transferencia de estos fragmentos a un filtro de fácil operación en su orden y posición original con isótopos radiactivos o no; -sustancias radiactivas El ADN sirve como una sonda que se hibrida con el ADN en la membrana (llamada hibridación Southern o detección enzimática que muestra que diferentes materiales tienen polimorfismos en los fragmentos de restricción de la sonda);
Las principales características de los marcadores RFLP son: (1) distribuidos por todo el genoma, el número es casi ilimitado (2) sin efecto fenotípico, no limitado por la etapa de desarrollo y la especificidad del órgano; *Se pueden distinguir dominantes, homocigotos y heterocigotos; (4) Los resultados son estables y confiables (5) Los requisitos de ADN son grandes y la tecnología de detección es compleja, lo que dificulta su uso en prácticas de mejoramiento a gran escala;
2 RAPD: Fundada por Williams = 1990, sus principios básicos son consistentes con la tecnología PCR.
La tecnología PCR es un método para amplificar rápidamente genes específicos o secuencias de ADN in vitro. Mullis fue el primero en establecer un sistema de reacción en un tubo de ensayo. Después de unas horas, una cantidad muy pequeña del gen diana o de un fragmento de ADN específico puede amplificarse millones de veces. El principio es similar al proceso de replicación del ADN en las células. Primero, cuando se calienta a temperaturas cercanas al punto de ebullición, la molécula de ADN bicatenario se separa en dos moléculas de ADN monocatenario. Luego, la ADN polimerasa utiliza ADN monocatenario como plantilla y utiliza cuatro desoxinucleósidos trifosfato (dNTP) en la mezcla de reacción para sintetizar una nueva cadena de ADN complementaria. El proceso anterior es un ciclo y el producto de cada ciclo se puede utilizar como plantilla para el siguiente ciclo. Después de 20 a 30 ciclos, el fragmento de ADN específico entre los dos cebadores puede replicarse geométricamente en grandes cantidades.
La tecnología de etiquetado RAPD utiliza uno (a veces dos) cebadores aleatorios (normalmente de 8 a 10 bases) para amplificar aleatoriamente el ADN genómico y luego utiliza electroforesis en gel para separar el genoma del material genético amplificado. Si se produce inserción, eliminación o mutación de bases de un fragmento de ADN en una región de unión de cebadores específica, puede provocar cambios correspondientes en la distribución de los sitios de unión de cebadores, lo que da como resultado un aumento o ausencia de productos de PCR o cambios en el peso molecular. Si el producto de PCR aumenta o falta, se producirán marcadores RAPD.
Las principales características de los marcadores RAPD son: (1) No se requiere sonda de ADN, y no se requiere información de secuencia para diseñar cebadores (2) Herencia dominante (muy pocos * * * dominantes), no puede ser; heterocigotos y homocigotos distinguidos (3) La tecnología es simple y no implica hibridación molecular ni autorradiografía (4) 4) La demanda de muestras de ADN es pequeña, los cebadores son baratos y el costo es bajo; es pobre y la confiabilidad de los resultados es baja.
3 AFLP: El marcador AFLP inventado por Zabeau y Vos en 1993 es el polimorfismo del producto de amplificación producido por la amplificación selectiva de fragmentos de restricción de ADN genómico, y su esencia también muestra fragmentos de endonucleasa de restricción, pero de longitud. este polimorfismo se detecta por diferencias en la longitud de los fragmentos amplificados. Esta tecnología combina la estabilidad de RFLP con la simplicidad y eficiencia de la tecnología PCR. Al mismo tiempo, puede superar las deficiencias de inestabilidad de la correa RFLP y la tecnología RAPD. Los principios técnicos básicos y los pasos operativos son los siguientes: primero digerir el ADN genómico con endonucleasas de restricción para formar muchos fragmentos de restricción aleatorios de diferentes tamaños; luego conectar ambos extremos de estos fragmentos con adaptadores de oligonucleótidos específicos y luego diseñar cebadores de acuerdo con la secuencia del adaptador; Debido a que hay tantos fragmentos de restricción, todos los productos amplificados son difíciles de separar en un gel. Por lo tanto, se añaden de 1 a 3 bases selectivas al tercer extremo del cebador, de modo que sólo aquellos fragmentos que pueden emparejarse con las bases selectivas se pueden combinar con el cebador y usarse como plantillas para la amplificación, logrando así la amplificación selectiva de los fragmentos de restricción. . objetivo. Finalmente, estos productos de amplificación específicos se separan mediante electroforesis en gel de poliacrilamida.
Las características principales de los marcadores AFLP son: (1) Dado que existen muchos tipos de enzimas de restricción y bases selectivas que se pueden usar en el análisis AFLP, la cantidad de marcadores producidos por esta tecnología es ilimitada (2; ) Análisis AFLP típico, las bandas de cada producto de reacción están entre 50 y 100, por lo que un análisis puede detectar múltiples sitios al mismo tiempo y el polimorfismo es extremadamente alto (3) * * Dominante, típico Meng Del Genetics (4; ) Alta resolución y resultados confiables; (5) Esta tecnología está actualmente protegida por patentes, los kits analíticos son costosos y las condiciones experimentales son duras.
4 SSR (SSLP): SSR, o ADN microsatélite, fue descubierto por Moore en 1991. Es un tipo de secuencia de ADN compuesta por varias (principalmente 1-5) bases, generalmente más largas que cortas y ampliamente distribuidos en diferentes partes del genoma.
Por ejemplo, (CA)n(AT)n(GGC)n, la variabilidad en el número de repeticiones de diferentes materiales genéticos conduce a una alta variabilidad en la longitud de SSR, que es la base para la generación de marcadores de SSR. Aunque el ADN microsatélite se distribuye en diferentes ubicaciones a lo largo del genoma, sus dos extremos son en su mayoría secuencias de copia única conservadas. Por lo tanto, se pueden diseñar un par de cebadores específicos basados en las secuencias en estos dos extremos para amplificar el microsatélite central entre ellos mediante PCR. Secuencia de ADN, su polimorfismo de longitud se obtiene mediante tecnología de análisis de electroforesis.
Las principales características de los marcadores SSR son: (1) abundantes y ampliamente distribuidos en todo el genoma; (2) variación alélica; (3) *** marcador dominante, que puede identificar heterocigotos y cigotos puros; (4) los experimentos son reproducibles y los resultados son confiables (5) debido a que es necesario conocer la información de la secuencia en ambos extremos de la secuencia repetida al crear nuevas etiquetas, desarrollarlas es difícil y costoso.