Haga una pregunta sobre PCR superpuesta

1. Intenté aumentar la longitud del área superpuesta, pero el resultado no se veía bien. El efecto de amplificación de la región superpuesta de 80 pb es mejor que el de la región superpuesta de 200 pb. Creo que la razón puede ser que el área de superposición es demasiado larga, lo que puede provocar un recocido más inespecífico.

2. Al cambiar el ciclo térmico, puede jugar un pequeño papel. Mi método es amplificar 10 veces a 50-60 C y configurar el tiempo de extensión en AC y BD, luego aumentar directamente la temperatura de recocido a 72 C, realizar 30 amplificaciones mediante un método de dos pasos y configurar el tiempo de extensión en AD Extendido; tiempo. Aunque todavía no se obtiene el resultado ideal, la mayoría de los fragmentos son AC y BD, y los fragmentos largos son muy, muy débiles.

3. Como dijo el moderador de Mybbff, también intenté ajustar la concentración del cebador. He visto la tecnología patentada TEM-PCR de Han Jian. El punto clave es ajustar la concentración del cebador para lograr el enriquecimiento de fragmentos. Combinado con el cambio de temperatura, la concentración de B y C se redujo a un nivel muy bajo. Hice A y D. La diferencia entre B y C es 50 veces. Mi idea es ajustar la concentración de BC a un nivel muy bajo. para que pueda El número se agota antes del período de amplificación, permitiendo que solo los cebadores de TM muy altos se extiendan cerca de 72C.

4. En la actualidad, no he obtenido los resultados ideales y la cantidad de fragmentos largos es mucho menor que la de AC y BD. Mi idea es prestar más atención a la hora de diseñar imprimaciones y zonas de superposición. Debe haber una gran diferencia en los valores de TM entre los cebadores, los cebadores a, d > b, C, A y D son ligeramente más largos. De acuerdo con estos cambios y luego ajustando el programa, creo que tendrá éxito.