El papel de la tecnología de electroforesis en la ingeniería de bioseparación
La primera tecnología de electroforesis fue propuesta por el profesor Svedberg del Departamento de Química Física de la Universidad de Uppsala en Suecia. El fenómeno de las partículas coloidales cargadas que se mueven en un campo eléctrico se llamó electroforesis.
En 1937, el profesor Arne Tiselius, ganador del Premio Nobel, utilizó estos fenómenos electroforéticos para inventar la electroforesis de interfaz más antigua para el estudio de la separación de proteínas, creando una nueva era en la tecnología de la electroforesis.
Desde entonces, han surgido varias tecnologías e instrumentos de electroforesis uno tras otro. El desarrollo continuo de instrumentos de electroforesis avanzados y tecnología de electroforesis ha hecho que ocupe una posición importante en la tecnología experimental bioquímica. , hay tres formas de electroforesis: en principio, se divide según el principio de electroforesis, es decir, electroforesis de interfaz móvil, electroforesis de zona y electroforesis de estado estacionario, o electroforesis de desplazamiento (desplazamiento).
En la electroforesis de la interfaz en movimiento libre, la velocidad de movimiento de las moléculas cargadas se mide observando el movimiento de la interfaz. Este método ha pasado a la historia.
En su lugar, se utiliza electroforesis zonal utilizando un medio de soporte.
Dependiendo del tipo de soporte utilizado, tamaño de partícula y método de electroforesis, el valor de aplicación clínica de la electroforesis zonal también varía.
Los medios de soporte sólidos se pueden dividir en dos categorías: uno es papel de filtro, película de acetato de celulosa, gel de sílice, alúmina, celulosa, etc.; el otro es almidón, agarosa y gel de poliacrilamida.
Debido a que tienen una estructura de red porosa fina, además de producir electroforesis, también tienen un efecto de tamiz molecular. Las moléculas pequeñas correrán más rápido que las moléculas grandes, mejorando así la resolución.
Su mayor ventaja es que apenas adsorbe proteínas, por lo que no se produce cola en la electroforesis.
La electroforesis en agarosa de baja concentración es equivalente a la electroforesis de interfaz libre. Las proteínas pueden penetrar libremente en el campo eléctrico. La fuerza negativa es pequeña, la separación es clara, la transparencia es alta y puede penetrar el tinte. con una longitud de onda de 200 a 7000 nm la sensibilidad de detección del cinturón, para lo cual el primer tipo de medio de soporte ahora ha sido reemplazado por el segundo tipo de medio de soporte.
La característica de la electroforesis estacionaria o electroforesis por desplazamiento es que la migración electroforética de partículas moleculares alcanza un estado estacionario después de un cierto período de tiempo, como el enfoque isoeléctrico y la isotacoforesis.
La electroforesis de zona es la tecnología más utilizada en el campo de las pruebas clínicas y tiene una importancia clínica importante. Especialmente otras nuevas tecnologías han ampliado su alcance de aplicación y han mejorado la tecnología de detección. El estado actual de esta tecnología es ahora. sobre el desarrollo.
1. La interpretación correcta de los resultados de la electroforesis es útil para el juicio clínico de la enfermedad.
El suero fresco puede representar con precisión la imagen general de las proteínas del paciente después de la electroforesis, y la más común es la albúmina. La disminución y el aumento de una determinada región de globulina indican un significado clínico diferente.
Por ejemplo, en la inflamación aguda, el porcentaje de áreas a1 y a2 puede aumentar, en el síndrome nefrótico y la glomerulonefritis crónica, la albúmina disminuye, la globulina a2 aumenta y la deficiencia de β-globulina también aumenta; , la zona beta puede aumentar debido al aumento de la transferrina recopilada y compilada por la Red de Educación Médica, mientras que la enfermedad hepática crónica o la cirrosis mostrarán una disminución significativa de la albúmina y un aumento de la r-globulina de 2 a 3 veces, lo que indica que la inmunoglobulina. se pueden observar aumentos policlonales, e incluso el fenómeno de puenteo de la fusión β-R, y también pueden estar presentes bandas oligoclonales delgadas y densas en la región R; no hay actividad de anticuerpos y se producen glóbulos inmunes uniformes por la proliferación anormal del plasma de un solo clon; Para la detección de la proteína llamada proteína M, la electroforesis de proteínas séricas es su método de diagnóstico experimental preferido.
Se puede ver una zona de proliferación de clones de proteínas altamente concentrada, densa y profundamente teñida en la región a2-r de la zona de electroforesis, que se llama zona de proteína m. Después del escaneo, una sola planta alta y estrecha. Se forma el pico, si la relación entre la altura del pico y el ancho de la base del pico de algunos picos en la región r es >2:1 y la tinción de fondo es clara debido a la limitación de la síntesis normal de inmunoglobulinas.
Un grupo de enfermedades causadas por la proteína M como son: mieloma múltiple, macroglobulinemia, enfermedad de cadenas pesadas, enfermedad de cadenas ligeras libres, enfermedad semimolecular, agammaglobulinemia monoclonal benigna y proteinemia Doble M, etc., estas enfermedades ya no son raros.
La electroforesis de proteínas séricas es de gran importancia para el diagnóstico precoz, la observación de la eficacia y el pronóstico de este tipo de enfermedades.
2. La combinación de la tecnología de electroforesis y la tecnología de inmunología ha ampliado enormemente el alcance de su aplicación clínica.
Permitiendo que la corriente acelere la difusión de antígenos y anticuerpos y especifique su dirección de funcionamiento, por lo que acelerando la velocidad de reacción de la precipitación.
Existen muchos tipos de técnicas de inmunoelectroforesis, como por ejemplo: Inmunoelectroforesis convectiva (CIEP), Inmunoelectroforesis en cohete (RIE) y Electroinmunodifusión (EID).
A partir del método de inmunoelectroforesis, constantemente se derivan algunas nuevas tecnologías, como la tecnología de inmunoelectroforesis (IEP). En 1969, Alper y Johnson recomendaron la electroforesis por inmunofijación (IFE) como método. Electroforesis de proteínas en gel de agarosa e inmunoprecipitación. Es una técnica híbrida de reacción de inmunoprecipitación. La muestra de prueba puede ser suero, orina, líquido cefalorraquídeo u otros fluidos corporales.
En 1976, se volvió a recomendar la tecnología de electroforesis por inmunofijación sérica (IF) para la tipificación de la proteína M.
Después de separar las proteínas del suero mediante electroforesis en medio de coagulación de agarosa, se aplican fijadores y diversos tipos de inmunoglobulinas y antisueros de cadenas ligeras a las calles de la superficie del gel. Después de la incubación, se aplican los fijadores y el antisuero. Penetra y se difunde en el gel, si la sustancia original correspondiente está presente, se formará un complejo antígeno-anticuerpo en el lugar apropiado.
Después de la tinción, el carril de referencia de la electroforesis de proteínas y la zona de precipitación antígeno-anticuerpo se tiñen con negro amino. Los componentes monoclonales se separan según la distancia del movimiento electroforético, y se pueden separar varios tipos de inmunoglobulinas y sus cadenas ligeras. clasificado.
Las mayores ventajas de esta tecnología son su sensibilidad de 50-150 mg/dl, ciclo de operación corto, de sólo unas horas, alta resolución y fácil análisis de resultados.
En la actualidad se utiliza con mayor frecuencia para la tipificación e identificación de la proteína M y se ha incluido en las pruebas de rutina en los laboratorios clínicos.
3. Tecnología de electroforesis para el análisis de isoenzimas para mejorar la tasa de diagnóstico
1. Isoenzima lactato deshidrogenasa sérica (iso-LDH): La determinación de la isoenzima LDH tiene electroforesis, cromatografía en columna de intercambio iónico, inmunoensayo, método inhibidor y método de digestión enzimática, pero hasta ahora el método más utilizado es la electroforesis en gel de agarosa.
Se deben separar cinco zonas de isoenzimas después de la separación por electroforesis. La LDH1 comienza a aumentar en promedio 6 horas después del inicio del infarto agudo de miocardio. LDH1/LDH2 ≥ 1 es un nivel decisivo positivo para la lesión de miocardio. Se puede ver que la LDH5 aumenta significativamente para determinar el contenido de cada zona, el espectro de isoenzimas después de la separación por electroforesis se cuantifica mediante escaneo, y la precisión es significativamente mayor que a simple vista.
2. La isoenzima creatina quinasa sérica (ISO-CK); la medición de CK y CH-MB siguen siendo los indicadores seleccionados que se utilizan actualmente para confirmar el infarto agudo de miocardio.
En los últimos años, algunas unidades domésticas han utilizado métodos de inmunosupresión para medir CK=MB. El principio es la actividad enzimática de la subunidad anti-M, ya que casi no hay CK=BB en el suero normal, multiplicándose. Se considera que este valor en 2 latas representa aproximadamente la actividad de CK-MB.
Este método es simple y rápido, pero la desventaja es la poca especificidad. Si hay CK-BB o CK anormal en el suero del paciente, se producirán aumentos falsos.
Muchos autores han informado de isoenzimas CD anormales, una llamada Maxro-CK, que es un complejo de CK-BB e inmunoglobulinas, que incluye tanto IgG como IgA. En suero normal, entre ellas, solo se cuenta Marco-CK. para el 0,8% -1,6% La otra se llama CK mitocondrial (CK-MT) y está unida a la superficie de las mitocondrias en los músculos, el cerebro y el hígado. La CK-MT en suero no aparece ni aparece durante el infarto de miocardio. Solo se puede detectar en suero cuando el tejido está extremadamente dañado debido a un daño extremo a las mitocondrias y las paredes celulares.
Dado que la Macro-CK y la CK-MT atípica no pueden ser inhibidas por los anticuerpos M, cuando aparecen provocarán un falso aumento de la actividad de la CK-MB que es superior a la actividad total de la CK.
El uso de electroforesis para separar CK-MB se basa en las diferentes estructuras moleculares de las CK-isoenzimas, que son recogidas y compiladas por la Red de Educación Médica en el tampón de electroforesis. Tienen diferentes cargas, que pueden tener diferentes cargas. ser del cátodo al ánodo Se separan los diferentes componentes de la CK, que son CK-MM, CK-MB y CK-BB. La característica de la electroforesis es que cuando hay 2 isoenzimas anormales como la CKⅠ gigante, la CKⅡ gigante, etc. ., se puede encontrar fácilmente a partir del patrón de electroforesis. El escáner escanea cada tira de enzima e informa el porcentaje de cada zona. Combinado con la actividad enzimática total, se obtiene el resultado de la determinación de omisión de enzima de la zona.
Macro-CK se encuentra entre CK-MM y CK-MB, mientras que CK-MT se ubica cerca del extremo del cátodo, detrás de CK-MM.
De esta manera, la CK-BB y diversas isoenzimas anormales no se confundirán con CK-MB ni se diagnosticarán erróneamente, y también se podrá solucionar la causa del falso aumento de CK-MB.
Por este motivo, la electroforesis de isoenzimas CK es una tecnología de prueba muy práctica y tiene una importancia clínica muy importante.
3. Isoenzimas del subtipo CK: Además, la electroforesis de enfoque isoeléctrico en gel de agarosa o la electroforesis de alto voltaje se utilizan a menudo para determinar los subtipos de CK-MB y CK-MM, ya que la operación es más problemática que la electroforesis ordinaria. it Las mediciones de rutina de rutina aún no están disponibles.
Los instrumentos de electroforesis automática introducidos actualmente se suministran con kits que se pueden utilizar para el análisis del subtipo de CK. Los valores de referencia son: CK-MM1 (57,7 ± 4,7)% es (26,5). ±5,3); CK-MM3 es (15,8±2,5)%; la relación CK-MM3/CK-MM1 es 0,28±0,05 (rango 0,15-0,39), y el nivel decisivo positivo es >0,5 MM3 es dominante en la sangre. el primer día de AMI, pero el segundo día A partir de ahora, MM1 será el modelo principal.
La electroforesis se utiliza para separar CKMB, CKMB1 y CKMB2. En la sangre humana normal, CK-MB2 es muy pequeña y la proporción general es aproximadamente igual a inexistente. circulación 4-6 h después del infarto agudo de miocardio, por lo que la proporción de MB2/MB1 aumentó significativamente, antes que el aumento en los fragmentos totales de CK-MB.
Esta proporción disminuye gradualmente una vez que se alivia el infarto de miocardio.
También se puede utilizar para observar el estado tras el tratamiento trombolítico.
4. Combinado con tecnología de anticuerpos inmunomarcadores enzimáticos para detectar bandas oligoclonales en el líquido cefalorraquídeo.
Algunos autores han informado que utilizan electroforesis bidimensional y tinción con plata para separar e identificar proteínas del LCR. Ahora se utiliza electroforesis en gel de agarosa de alta resolución para separar las proteínas en el LCR, y la "banda oligoclonal" (OCB) se identifica reaccionando con el antígeno y el anticuerpo IgG específico marcado con peroxidasa de rábano picante. En esta tecnología de amplificación de inmunomarcaje enzimático y paso de desarrollo del color, la concentración de proteína se puede detectar cuando alcanza 31-125 ul/L, lo que puede aumentar la sensibilidad de detección 100 veces. De esta manera, no es necesario concentrar el líquido cefalorraquídeo y. Se evita la pérdida de proteínas durante el proceso de concentración.
Puede usarse para confirmar y distinguir las inmunoglobulinas OCB y sus tipos.
Si se detecta OCB en la muestra de líquido cefalorraquídeo, pero no se detecta ninguna zona en la muestra correspondiente, se considera positiva, lo que verdaderamente refleja que se trata de una inmunoglobulina sintetizada por el propio sistema nervioso central, que tiene importancia clínica importante.
Es una prueba cualitativa en la esclerosis múltiple, el OCB es un marcador muy importante.
Sin embargo, el suero y el LCR del paciente deben analizarse simultáneamente el mismo día para identificar inmunoglobulinas de diferentes fuentes.
La inmunoglobulina sintetizada centralmente es una señal importante para las enfermedades del sistema nervioso central. Se utiliza principalmente para el diagnóstico diferencial de enfermedades del sistema nervioso central como: esclerosis múltiple, demencia, mielitis y encefalitis neoplásica, neuromesina. etc.
5. Utilice reacciones de antígenos y anticuerpos en fase sólida para separar la lipoproteína (a) para la detección de factores de riesgo independientes en el corazón y el cerebro.
Esta tecnología utiliza reacciones de antígenos y anticuerpos. Identificar lipoproteínas separadas electroforéticamente.
Después de electroforetizar el suero en gel de agarosa y luego teñirlo, pueden aparecer bandas de diferentes lipoproteínas.
Debido a los diferentes puntos isoeléctricos de las lipoproteínas en el gel, no sólo se pueden distinguir las zonas a, pre-β y β, sino también porque el medio contiene anti-lipoproteína (a) LP (a) anticuerpos y cationes, Anti-LP(a) se combina con LP(a) en el suero del paciente para formar un complejo. Los cationes inhiben la velocidad de natación de otras lipoproteínas, y LP(a) se separa de otras lipoproteínas, formando LP(. a) claramente distinguible) La banda aparece entre las regiones pre-β y γ. Después de escanear la banda positiva, se puede obtener el área y el porcentaje de la zona. Este método hace que la tecnología de electroforesis sea más perfecta y reduce en gran medida las desventajas de la manual. operación se puede utilizar de forma semicuantitativa y la película se puede guardar para una fácil comparación.
Mejora la sensibilidad y especificidad de la detección de LP(a), un factor de riesgo independiente de enfermedades cardiovasculares y cerebrovasculares.
6. Realice una electroforesis de proteínas en orina no concentrada según el peso molecular para distinguir los tipos de proteínas en la orina.
La electroforesis de proteínas en la orina puede separar varias proteínas en la orina para distinguir los tipos de proteínas en la orina. determinar clínicamente la ubicación del daño renal sin ninguna operación.
Algunos laboratorios nacionales utilizan electroforesis en disco SDS-PAGE para separar las proteínas de la orina. Este método tiene limitaciones, requiere mucho tiempo, es complicado de operar, requiere una gran cantidad de muestras y requiere una preconcentración de la orina, lo que lo hace inadecuado para su uso. laboratorios clínicos ampliamente realizados.
La electroforesis SDS=AGE no requiere preconcentración. Después de la electroforesis de proteínas en orina, mostrará zonas proteicas de peso molecular medio y alto, que reflejan principalmente lesiones glomerulares; mostrará zonas proteicas de bajo peso molecular, que pueden ser; Se observa en lesiones tubulares renales y proteinuria por desbordamiento; en la proteinuria mixta, se pueden ver zonas de peso molecular grande, mediano y pequeño, lo que indica que tanto los glomérulos como los túbulos renales están involucrados.
El escáner puede escanear el perfil de proteínas en la orina después de la electroforesis y calcular el porcentaje para mostrar el grado de daño tubular glomerular o renal. El patrón de electroforesis y el patrón de exploración se pueden utilizar como datos nacionales para siempre. análisis y comparación.
El mayor avance de esta tecnología recogida y recopilada por Medical Education Network es que no es necesario preconcentrar la orina, el funcionamiento es sencillo, los resultados son claros, la prueba se puede completar en sólo tres horas, y también están disponibles estándares cualitativos completos, es fácil de cuantificar y analizar, y es valioso para el diagnóstico y diagnóstico diferencial de enfermedades renales, guiar el tratamiento y juzgar la curación.
La electroforesis capilar recientemente desarrollada es un nuevo tipo de electroforesis zonal, también conocida como electroforesis zonal capilar.
Consiste en cargar una solución tampón en un tubo capilar, inyectar una muestra en un extremo del tubo capilar, aplicar un alto voltaje CC a ambos extremos del tubo capilar para separar la muestra y separar la muestra. las muestras pasan a través del dispositivo de detección en un extremo del tubo capilar a su vez.
La electroforesis capilar también se utiliza mucho en medicina de laboratorio. Según la procedencia de las muestras analizadas, se pueden dividir en muestras de orina, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, glóbulos rojos y otros fluidos o tejidos corporales. , y animales vivos de experimentación, etc.
Desde la perspectiva de los objetos de separación, incluye proteínas, péptidos, aminoácidos, azúcares, enzimas, ADN, oligonucleótidos, virus, moléculas pequeñas y biológicamente activas, iones, fármacos y sus metabolitos, etc.
Según su finalidad, se puede dividir en diagnóstico clínico de enfermedades, análisis clínico de proteínas, análisis clínico de fármacos, investigación metabólica, investigación patológica, análisis de isoenzimas, análisis de productos de PCR, análisis de secuencias y fragmentos de ADN, etc.
Por su incomparable eficacia y rapidez, ha atraído cada vez más la atención de los científicos.
La tecnología de electroforesis de China comenzó no demasiado tarde, pero debido a varias razones, la mayoría de los laboratorios todavía utilizan equipos de electroforesis relativamente atrasados.
Con el rápido desarrollo de la ciencia y la tecnología nacionales e internacionales y el rápido desarrollo de la medicina de laboratorio, la tecnología de electroforesis también se desarrolla y actualiza constantemente y tiene un valor de aplicación extremadamente amplio en los campos de la medicina clínica y la biología molecular. Creo que Con el desarrollo continuo de esta tecnología, se volverá cada vez más popular entre los colegas.