Método de síntesis total de genes
La tecnología de síntesis de genes completos está muy madura. El enfoque general es diseñar y sintetizar oligonucleótidos monocatenarios superpuestos y empalmar la longitud completa mediante PCR de extensión superpuesta. Hay mucha información sobre los métodos de síntesis total de genes en Internet y hay cientos de patentes relacionadas con la síntesis de un único gen total. Los más comunes incluyen PCR de extensión superpuesta (OE-PCR), PCR doble asimétrica (DA-PCR) [2], reacción en cadena de la polimerasa (PCR) [3], reacción en cadena de ligasa (LCR) [4], del equilibrio termodinámico de adentro hacia afuera. (TBIO). Para ser honesto, no he estudiado estos métodos detenidamente. No importa cómo se llamen, siempre es lo mismo: PCR, basada en ciertos cebadores cortos superpuestos, que extienden gradualmente el fragmento en crecimiento mediante una polimerasa.
¿Cuál es la forma más sencilla de sintetizar un gen completo?
Por supuesto que lo sintetice la empresa de síntesis de ADN. Sólo necesitamos proporcionar información de la secuencia de ADN. Sintetizarán dsDNA y lo clonarán en un vector universal y, en general, proporcionarán información de secuenciación para garantizar la precisión de la síntesis. Este es sin duda el método más sencillo y cómodo. Además, toda la síntesis genética es ahora muy barata: 1 pb de secuenciación cuesta menos de un dólar.
Dado que las empresas de síntesis de ADN son tan convenientes, ¿por qué necesitas sintetizarlo tú mismo?
①La síntesis de la empresa es lenta y suele tardar entre 1 y 2 semanas. Si encuentra secuencias especiales, como secuencias codificantes que son extremadamente tóxicas para E. coli, el tiempo del ciclo es difícil de predecir (hice una nucleasa, pero la compañía de síntesis no la fabricó durante un mes y la terminé en una semana).
②No es gratuito. Normalmente, las empresas de síntesis proporcionan los vectores recombinantes que portan el gen de interés. Una vez obtenido hay que cortarlo con enzimas. Esto debe evitarse si el gen contiene sitios de escisión de enzimas. Por supuesto, estos generalmente no son grandes problemas, pero realmente no hay nada que puedas hacer al respecto.
(3) Como se mencionó anteriormente, la síntesis total de genes se usa generalmente para la expresión de genes heterólogos. La mayoría de los objetos de expresión heteróloga son enzimas, y puede ser necesario construir una gran cantidad de mutantes para estudiarlos. propiedades de las enzimas. La empresa de síntesis sólo proporciona una secuencia y los mutantes deben reconstruirse mediante el diseño de cebadores. Si el gen completo se sintetiza por sí solo, se pueden obtener varios mutantes al mismo tiempo reemplazando los cebadores que contienen mutaciones, lo que resulta más ventajoso cuando se construyen mutantes que contienen una gran cantidad de mutaciones.
La secuencia debe mantenerse en secreto, después de todo, tú eres el más confiable.
Siempre hay gente a la que le gusta tener suficiente comida y ropa. En este artículo, presentaré el método de autosíntesis y presentaré dos métodos:
Método de empalme de 1 disparo basado en PCR "puente"
Este método se basa en la relación entre Los cebadores se hibridan entre sí y se extienden entre sí como plantilla, por lo que los cebadores requeridos son siempre uno positivo y otro negativo. Primero, divida toda la secuencia genética en oligonucleótidos cortos, generalmente de no más de 59 pb, porque generalmente la síntesis de cebadores se basa en 59 pb como línea divisoria de aguas, y el precio y el costo de tiempo serán mucho mayores si excede los 59 pb. El oligonucleótido se hibrida con la secuencia complementaria en el extremo 3' para formar un producto bicatenario con huecos, y luego la ADN polimerasa llena el hueco para formar un producto bicatenario de ADN con huecos. El producto se liga mediante la ADN ligasa Taq para formar un producto bicatenario completo, que puede usarse como plantilla para la amplificación por PCR para obtener el gen objetivo, o las dobles hebras de ADN con espacios se pueden usar directamente como plantilla para la PCR. amplificación.
2 Método paso a paso basado en expansión paso a paso
En este método, solo el último cebador está inverso, los demás están hacia adelante y hay secuencias superpuestas. El penúltimo oligonucleótido y el penúltimo oligonucleótido se hibridan entre sí a través de secuencias complementarias terminales. Después del primer ciclo de PCR, el dúplex se extiende, y el dúplex extendido y el penúltimo oligo continúan hibridándose y extendiéndose, y así sucesivamente hasta que se sintetiza la secuencia completa. En teoría, solo se puede extender un cebador en un ciclo de PCR, y ningún oliog necesita pasar por al menos n ciclos de PCR. Dado que solo hay un extremo extendido, el diseño del cebador es más simple que el método 1 y no es necesario que el número de cebadores sea par.
1. Diseño de cebadores de PCR.
Puede utilizar herramientas de diseño automático o diseño manual, que se presentarán en detalle más adelante. Si está diseñado manualmente, se recomienda usar SnapGene (sin mencionar el poder de este software, debes saber que hay muchas versiones crackeadas en Internet, no pretendas ir a Baidu). Después de copiar la secuencia genética completa, primero abra el panel "Preferencias", busque la opción "Primer" y establezca la longitud coincidente más corta y la Tm más baja del extremo 3' en 10 pb y 40 respectivamente.
Debido a que el desajuste del terminal 3' es muy perjudicial para todo el método de síntesis de genes descrito en este artículo, si estas dos configuraciones son demasiado bajas y es difícil diseñar cebadores, se pueden aumentar apropiadamente a 12 pb y 45°C. De lo contrario, los codones sólo podrán optimizarse y rediseñarse.
La longitud del cebador está predeterminada en 59 pb. La atención se centra en el diseño de la región superpuesta, que generalmente se determina en función de la Tm de la región superpuesta. El equilibrio de Tm entre diferentes áreas superpuestas es muy importante.
Tm no supera los 3 ℃ y se recomienda establecer Tm entre 55 y 58 ℃. Cabe señalar que para el primer método de este artículo, el número de cebadores debe ser un número par, uno por uno desde el comienzo de la secuencia. El punto de partida del siguiente oligonucleótido es el final del área superpuesta anterior. La parte de arriba es recta y la de abajo es al contrario. Si el último número es impar, las longitudes de los últimos cebadores deben ajustarse para formar un cebador inverso.
Para el segundo método, tira de la dirección hacia adelante desde el principio de la secuencia y todo el resto es hacia atrás hasta el final, o puedes tirar de la dirección inversa desde el final y el resto es hacia adelante hasta el principio. . A este método no le importa la cantidad de cebadores.
El producto completo se obtuvo mediante PCR.
Generalmente se requieren dos rondas de PCR. Agregue una pequeña cantidad de cebadores en la primera ronda; se recomienda usar 0,5-1 pmol/oligo en un sistema de 50 uL y 10-15 ciclos para obtener la plantilla completa. La ADN polimerasa recomendada para esta ronda de PCR debe perder las actividades exonucleasas 3'-5' y 5'-3', lo que destruirá el equilibrio de Tm en el área de superposición. En la segunda ronda, se usó 1 ul de producto de PCR como plantilla, se agregaron 20 pmol de cebadores de longitud completa en sentido ascendente y descendente y se obtuvo el gen diana en 20-25 ciclos. Esta ronda de PCR utiliza ADN polimerasa de alta fidelidad.
3. Clonar en vector de expresión.
Inserte el gen diana en el vector mediante recombinación homóloga, ligadura con endonucleasa de restricción y otros métodos, transforme E. coli u otras células huésped competentes y obtenga un único clon. Se recomienda que antes de la síntesis genética completa, se diseñen brazos de homología o sitios de restricción para vectores de clonación/expresión y se agreguen directamente a la secuencia genética completa. De lo contrario, los cebadores se deben diseñar por separado para agregar brazos de homología o sitios de restricción.
4. Secuenciación e identificación
Los clones positivos se identificaron mediante PCR y se secuenciaron. Se puede utilizar el clon correcto para la expresión y purificación posteriores.
Optimizador:/gems, no se puede abrir.
GeneDesign [12]: De la investigación del genoma. El enlace en el documento es:/tools/104.html, que definitivamente se abrirá. Esta es una herramienta que escribí yo mismo, que incluye análisis y optimización de codones, conversión automática de genes en oligonucleótidos y generación de planes experimentales de referencia. Los oligómeros resultantes tienen longitudes uniformes y las regiones superpuestas tienen el mismo valor de Tm. La fórmula de cálculo para Tm es: Tm = 64+0,41×GC-528/n Para obtener más información, consulte mi método de diseño de cebador de PCR. El oligo generado se puede copiar con un clic, el formato es oligo+número de serie+espacio+Tab+secuencia (5'-3') y se puede importar directamente a SnapGene.
SnapGene puede reconocer los cebadores generados por mi programa. Haga clic en la herramienta "Cebadores" en la barra de menú, haga clic en la opción "Importar cebadores de la lista" y seleccione importar secuencias desde el portapapeles.
Puedes comprobar si cada cebador cubre completamente la secuencia objetivo, si la "cabeza y cola" de los cebadores entran en conflicto, etc.
Prueba utilizando GFP como secuencia objetivo:
① Busque la secuencia de la proteína fluorescente verde NCBI y péguela en el cuadro de texto. Primero, analice la preferencia de codones;
Los codones raros de E. coli están marcados en rojo, lo que indica que hay muchos codones raros en el gen natural GFP y que primero se puede realizar la optimización de codones.
② Hay dos formas de generar oligómeros. El valor predeterminado es el método 1. Si los cebadores tienen una gran similitud, se le pedirá que utilice el método 2.
Haga clic en el botón Generar oligonucleótido para que aparezca información estadística sobre el número total de bases, luego genere el número de secuencia y la secuencia del oligonucleótido, y genere un botón de protocolo experimental y un botón de copia. Después de copiar con un clic, se puede importar al análisis de SanpGene.
③Análisis genético
El gen GFP está completamente cubierto, incluso con cebadores, y la Tm entre cebadores es básicamente la misma (debido a que el algoritmo Tm del programa es inconsistente con SnapGene, solo se puede ver en SnapGene Básicamente lo mismo
(4) Generar plan experimental
Generalmente, la síntesis genética total in vitro no debe exceder los 1000 pb si se realiza una síntesis única. demasiado largo, la probabilidad de error aumentará. Recomiendo segmentos de 800 pb, el programa recomendará la cantidad de segmentos según la longitud de la secuencia que ingrese.
Espero que esta herramienta pueda ayudarlo a completar el gen completo. síntesis. También he escrito una herramienta para ayudar en la construcción de vectores, que se presentará más adelante
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Referencias
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