¿Qué es la tecnología de marcadores moleculares?

Los marcadores moleculares son una forma ideal de marcadores genéticos desarrollados después de los marcadores morfológicos, los marcadores celulares y los marcadores bioquímicos. Se basa en la mutación de proteínas y moléculas de ácido nucleico para detectar la estructura genética de los organismos y sus variaciones. La tecnología de marcadores moleculares esencialmente refleja las diferencias entre organismos individuales al detectar variaciones en sus genes o genotipos. Cada marcador molecular tiene sus propias características y alcance de aplicación específico, pero en general, en comparación con los marcadores morfológicos y los marcadores bioquímicos, los marcadores moleculares de ADN tienen muchas ventajas únicas: ① No se ven afectados por el tipo de tejido ni la etapa de desarrollo. Se puede utilizar cualquier tejido de la planta para el análisis en cualquier etapa de desarrollo. ②No afectado por el medio ambiente. Porque el entorno sólo afecta la expresión genética (transcripción y traducción), pero no cambia la estructura genética, es decir, la secuencia de nucleótidos del ADN. ③La cantidad de marcadores es grande y cubre todo el genoma. ④Alto polimorfismo y muchas variaciones alélicas naturales. ⑤ Muchos marcadores son * * dominantes y pueden distinguir entre genotipos homocigotos y heterocigotos, proporcionando información genética completa. ⑥La tecnología de etiquetado molecular de ADN es simple, rápida y fácil de automatizar. ⑦Las muestras de ADN extraídas se pueden almacenar durante mucho tiempo en condiciones adecuadas, lo que favorece la trazabilidad o la identificación por arbitraje. Por lo tanto, los marcadores moleculares de ADN pueden compensar y superar muchos defectos y problemas en la identificación morfológica, la identificación por electroforesis de isoenzimas y proteínas, mostrando así amplias perspectivas de aplicación en la identificación de variedades.

1.1 ?Marcadores moleculares de 1ª generación

1.1.1 ?Tecnología de etiquetas RFLP.

El polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) propuesto por Botesin en 1980 puede utilizarse como marcador genético, creando una nueva etapa de aplicación directa del polimorfismo del ADN y siendo la primera tecnología de marcadores moleculares. RFLP detecta el tamaño de fragmentos de ADN específicos formados después de la digestión con endonucleasa de restricción, lo que refleja la distribución de diferentes sitios de restricción en las moléculas de ADN. Por lo tanto, pequeños cambios en la secuencia de ADN, incluso cambios en 65.438+0 nucleótidos, pueden causar la pérdida o creación de sitios de escisión de endonucleasas de restricción, lo que resulta en cambios en la longitud de los fragmentos de endonucleasas de restricción.

Ventajas: Los alelos de los marcadores RFLP tienen * * * características dominantes, los resultados son estables, confiables y reproducibles, y son particularmente adecuados para construir mapas de ligamiento genético.

Desventajas: En el análisis RFLP, se requiere el fragmento de ADN del sitio como sonda, y las técnicas de hibridación de radioisótopos y ácidos nucleicos no son seguras ni fáciles de automatizar. Además, RFLP no es sensible a la detección de polimorfismos de ADN y hay muchas regiones espaciales grandes en el mapa de enlace de RFLP.

1.1.2 ?Tecnología de marcado RAPD.

Para superar las deficiencias de la tecnología RFLP, Williams estableció la tecnología de ADN polimórfico amplificado aleatorio (RAPD) en 1990. Debido a su forma única de detectar polimorfismos del ADN, la tecnología RAPD ha penetrado rápidamente en varios campos de la investigación genética. RAPD es una tecnología de marcadores moleculares basada en PCR. El principio básico es utilizar un cebador aleatorio (8 ~ 10 bases) para amplificar aleatoriamente fragmentos de ADN mediante una reacción de PCR y luego utilizar electroforesis en gel para separar los fragmentos amplificados para estudiar los polimorfismos del ADN. Para cualquier cebador específico, existe un sitio de unión específico dentro de la secuencia de ADN genómico. Una vez que el genoma tiene inserciones, eliminaciones o mutaciones de bases de fragmentos de ADN en estas regiones, la distribución de estos sitios de unión específicos puede cambiar, lo que resulta en cambios en el número y tamaño de los productos amplificados, mostrando polimorfismo.

Ventajas: En comparación con RFLP, la tecnología RAPD es simple, detección rápida, menor consumo de ADN, equipo experimental simple, no se necesitan sondas de ADN, no se requiere preclonación, etiquetado o análisis de secuencia al diseñar cebadores. y no es específico de especie. Efectos del sexo y la estructura del genoma. Se puede utilizar un conjunto de cebadores sintéticos para el análisis del genoma de diferentes organismos. Un cebador puede amplificar múltiples fragmentos, no requiere isótopos y es seguro.

Desventajas: por supuesto, la tecnología RAPD se ve afectada por muchos factores y la estabilidad y repetibilidad del experimento son deficientes. En primer lugar, se trata de herencia dominante y no se pueden identificar sitios heterocigotos, lo que hace que el análisis genético sea relativamente complicado. En el mapeo de genes y el mapeo genético de ligamiento, la precisión del cálculo de las distancias genéticas entre loci debido a la cobertura dominante es una función de la especificidad y la estructura del genoma. Se puede utilizar un conjunto de cebadores para el análisis del genoma de diferentes organismos. Un cebador puede amplificar múltiples fragmentos y no requiere isótopos, lo cual es seguro. Por supuesto, la tecnología RAPD se ve afectada por muchos factores y la estabilidad y repetibilidad de los experimentos son deficientes. En primer lugar, se trata de herencia dominante y no se pueden identificar sitios heterocigotos, lo que hace que el análisis genético sea relativamente complicado. Al realizar el mapeo de genes y el mapeo genético de ligamiento, la precisión del cálculo de las distancias genéticas entre loci se reduce debido a la cobertura dominante. En segundo lugar, RAPD es muy sensible a las condiciones de reacción, incluida la concentración de plantilla y la concentración de Mg2+, por lo que la repetibilidad de los experimentos es pobre.

1.3 ?Tecnología de marcado AFLP

? El polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados (AFLP), también conocido como amplificación selectiva de fragmentos de restricción 2 (SRFA), fue inventado por Zabean y Vos de la empresa holandesa KEYGENE en 1993 y ha solicitado una patente. AFLP es una tecnología de marcadores moleculares que se ha desarrollado rápidamente en los últimos años.

Conecta los fragmentos de ADN genómico digeridos por pares de endonucleasas de restricción con un adaptador (complementario al sitio de restricción), y amplifica una gran cantidad de fragmentos de ADN a través de un cebador semiespecífico cuyo extremo 5' es complementario al adaptador, formando así Tecnología de marcado molecular para huellas dactilares. Las huellas dactilares AFLP son herencia mendeliana dominante y recesiva.

Ventajas: Tiene las ventajas tanto de RAPD como de RFLP y tiene una alta estabilidad. Se puede detectar una gran cantidad de loci en poco tiempo con una pequeña cantidad de cebadores selectivos, y los muchos loci detectados por cada par de cebadores se distribuyen más o menos aleatoriamente en múltiples cromosomas. El número de marcadores AFLP en cada cromosoma se correlaciona positivamente con la longitud del cromosoma (r = 0,501), mientras que el número de cromosomas cubiertos por un par de cebadores se correlaciona positivamente con el número de marcadores (r = 0. Por lo tanto, se puede obtener cobertura con una pequeña cantidad de combinaciones de cebadores eficientes Marcadores AFLP de todo el genoma Actualmente, AFLP, como tecnología de huellas dactilares eficiente, ha ejercido sus ventajas en la investigación de reproducción genética.

Desventajas: Sin embargo, algunos estudios creen que AFLP requiere. mayor pureza del genoma y condiciones de reacción. Además, cuando se utilizan para el mapeo genético, algunos marcadores difieren en su cercanía al mapa. Además, se basan en tecnologías RAPD y RFLP, SCAR (regiones amplificadas de caracterización de secuencias) y CAPS (escisión amplificada). secuencias polimórficas) y daf (huella digital de amplificación de ADN am 2). La aparición de estas tecnologías ha enriquecido y mejorado aún más la tecnología de marcadores moleculares de primera generación y ha aumentado los métodos de investigación de las personas sobre los polimorfismos del ADN. generación. Marcadores moleculares

2.1 ?Tecnología de marcadores SSR

Hay muchas secuencias repetitivas no codificantes en los genomas eucariotas, como el ADN microsatélite con longitudes unitarias repetidas de 15 a 65 nucleótidos (. ADN microsatélite con una longitud de unidad repetida de 2 a 6 nucleótidos. Los microsatélites y el ADN microsatélite se distribuyen en diferentes sitios a lo largo del genoma. Debido al diferente tamaño y orden de las unidades repetidas, el número de copias también es diferente, formando un polimorfismo de longitud rico. Moore creó la tecnología de marcadores SSR (repetición de secuencia simple) en 1991. SSR, también conocido como ADN microsatélite, es un tipo de ADN compuesto por varias repeticiones en tándem de secuencias (principalmente de 1 a 5, las más comunes). secuencias repetidas de dinucleótidos, a saber (CA) n y (TG) N. La estructura de secuencia central de cada ADN microsatélite es la misma, con un número de unidades repetidas que oscila entre 10 y 60. Su alto grado de polimorfismo se deriva principalmente del número de tándems El diferente número de repeticiones de diferentes materiales genéticos conduce a una alta variabilidad en la longitud de SSR, que es la base de los marcadores SSR. El principio básico de los marcadores SSR: diseñar cebadores basados ​​en secuencias cortas específicas en ambos extremos de la secuencia de repetición del microsatélite. y realizar reacciones de PCR. Amplificación de fragmentos de microsatélites. Debido al diferente número de repeticiones de la secuencia central, la amplificación de productos de PCR de diferentes longitudes es un método eficaz para detectar polimorfismos de ADN. es un buen marcador molecular Actualmente, los marcadores microsatélites se han utilizado para construir mapas genéticos cromosómicos de humanos, ratones, ratas, arroz, trigo, maíz y otras especies.

Ventajas: Estos marcadores microsatélites. Se utilizan en mapeo y clonación de genes, diagnóstico de enfermedades, análisis genético o identificación de variedades, mejoramiento de cultivos, investigación evolutiva y otros campos. Además, los marcadores SSR no solo pueden identificar homocigotos y heterocigotos, sino que también tienen resultados más confiables y métodos más simples. y esfuerzo.

2.2 ?Tecnología de etiquetado ISSR

ISSR es una nueva tecnología de etiquetado molecular. En 1994, Zietkiewicz desarrolló la tecnología de oligonucleótidos anclados. Utilizaron oligonucleótidos microsatélites anclados como cebadores, es decir, agregaron de 2 a 4 nucleótidos seleccionados aleatoriamente en el extremo 5' o 3' del SSR, lo que puede provocar la hibridación de sitios específicos, lo que resulta en la unión a los cebadores anclados para la amplificación por PCR de fragmentos genómicos entre secuencias repetidas complementarias. Este marcador también se conoce como repetición de secuencia ISSR), assr (repetición de secuencia simple anclada) o AMP2PCR. Entre los cebadores de doble ala utilizados, uno puede ser un cebador ASSR y el otro puede ser un cebador aleatorio. Si uno es un cebador ASSR con un ancla en el extremo 5' y el otro es un cebador aleatorio, se llama tecnología RAMP [19]. Los cebadores utilizados en la amplificación por PCR de ISSR2 suelen ser secuencias de 16 a 18 bases, que constan de 1 a 4 repeticiones en tándem de bases y varias bases de anclaje no repetitivas, asegurando así que los cebadores estén conectados al extremo 5' o 3' del SSR en ADN genómico combinado, los fragmentos de ADN entre SSR se amplifican mediante una reacción de PCR.

Ventajas: La distribución de SSR en eucariotas es muy común y la velocidad de evolución y mutación es muy rápida, por lo que ISSR2PCR con cebadores ancla puede detectar diferencias en muchos sitios del genoma. En comparación con la PCR SSR-2, los cebadores utilizados en la PCR ISSR-2 no requieren secuenciación previa del ADN, razón por la cual algunos cebadores ISSR pueden no tener regiones emparejadas en el ADN genómico específico y no tener productos de amplificación, generalmente marcadores de herencia mendeliana. con buena estabilidad y polimorfismo.

1.3 ?Marcadores moleculares de tercera generación

3.1 ?Tecnología de marcadores SNP.

El polimorfismo de un solo nucleótido (Single Nucleotide Polymorphism, SNP) es el llamado marcador molecular del ADN de tercera generación, que se refiere a un único nucleósido entre diferentes alelos en un mismo sitio. Las diferencias ácidas incluyen la deleción o inserción de un solo nucleótido. base o, más comúnmente, la sustitución de un solo nucleótido, que a menudo ocurre entre bases purínicas (A y G) y bases pirimidínicas (C y T). Los marcadores SNP pueden ayudar a distinguir diferencias en el material genético entre dos individuos y se consideran los marcadores genéticos más prometedores. Actualmente, se han mapeado más de 2000 marcadores en los cromosomas humanos y se han desarrollado 236 marcadores SNP en Arabidopsis. Aproximadamente el 30% de los marcadores SNP contienen polimorfismos en sitios de restricción.

Ventajas: La mejor forma de detectar SNP es la tecnología de chip de ADN. La electroforesis en microchip recientemente informada puede detectar SNP en muestras clínicas a alta velocidad, lo que es 10 y 50 veces más rápido que la electroforesis capilar y la electroforesis en placas, respectivamente. El SNP se diferencia del RFLP de primera generación y del SSR de segunda generación en dos aspectos: en primer lugar, el SNP ya no utiliza el cambio de longitud de los fragmentos de ADN como método de detección, sino que utiliza directamente la variación de secuencia como marcador; en segundo lugar, el análisis del marcador SNP; abandona por completo la clásica electroforesis en gel, sustituida por la última tecnología en chips de ADN.

3.2 ?Tecnología de marcado EST.

Las etiquetas de secuencia expresada (EST) fueron propuestas por Venter, biólogo de los Institutos Nacionales de Salud (NIH), en 1991. Con el desarrollo del Proyecto Genoma Humano, la tecnología EST se ha utilizado ampliamente en campos de investigación como el descubrimiento de nuevos genes humanos, la elaboración de mapas del genoma humano y la identificación de regiones codificantes de secuencias del genoma, y ​​se ha utilizado ampliamente en la investigación del genoma de las plantas. EST se refiere a la clonación y secuenciación aleatoria en bibliotecas de ADNc de diferentes tejidos para obtener secuencias parciales de ADNc. Un EST corresponde a la secuencia del clon de ADNc de un determinado ARNm, generalmente tiene una longitud de 150 a 500 pb y solo contiene la región codificante del gen.

Ventajas: EST puede representar un gen expresado de un organismo en un momento determinado, por lo que se denomina "identificación de secuencia expresada" sin embargo, el número de EST muestra el número de copias del gen que representa; Cuantas más veces se expresa un gen, más clones de ADNc tiene. Por lo tanto, mediante la secuenciación y el análisis de clones de ADNc, se puede conocer la abundancia de expresión de los genes. Actualmente, los kits se utilizan generalmente para construir bibliotecas de ADNc. El rápido desarrollo de la tecnología de secuenciación de ADN permite reducir aún más el costo de la secuenciación de ADN a gran escala.