¿Qué es la biotecnología de plantas hortícolas?
Después de que en 1983 se obtuvieran las primeras plantas transgénicas de tabaco y patata, McGrananhan et al [1] en 1988.
Se obtiene el primer árbol frutal-nogal modificado genéticamente. En 1990, obtuvieron un gen para las nueces resistente a los insectos. Zain
Tres años después de que los científicos obtuvieran cultivos transgénicos mediante bombardeo de partículas, el bombardeo de partículas se aplicó con éxito a la papaya[2]
. En 1994, Kalinsky contó patentes sobre plantas genéticamente modificadas, incluidas manzanas y manzanos. Los investigadores nacionales
conceden gran importancia a la investigación sobre modificaciones genéticas. Huang Xuesen et al. [3] publicaron la transformación genética de las uvas; Cheng Jiasheng et al. [4] introdujeron la tecnología de transferencia de genes de la manzana. Posteriormente, plántulas de manzana transgénicas [5j; Fu Runmin et al.
Introducción sistemática a la ingeniería genética y su aplicación en árboles frutales [6, 7]
Laboratorio Nacional Clave de Biotecnología de Cultivos Tropicales de la Academia China de Ciencias Agrícolas Tropicales
;El laboratorio ya ha realizado trabajos con papaya transgénica [8 ~ 11]
; el Instituto de Investigación de Cítricos de la Academia China de Ciencias Agrícolas y la Universidad Agrícola del Sur de China han desarrollado una piel antibacteriana.
La investigación sobre la transferencia de genes de cítricos [12, 13]; la Universidad Agrícola de Shenyang obtuvo plantas transgénicas de la principal variedad de manzana 'New Jona Gold' [14 ~ 16].
La Universidad Agrícola de Fujian desarrolló el longan[17] y la pasiflora[18].
La transformación genética y la investigación transgénica en árboles frutales subtropicales como las polillas murciélagos; la magnífica
Universidad Agrícola de China y otras han promovido el progreso de la ingeniería genética de árboles frutales en términos de metodología [19, 20]
. También se realiza transformación transgénica o genética.
Múltiples unidades [21 ~ 24]
. La investigación sobre árboles frutales genéticamente modificados se ha convertido en un tema candente. El autor intenta resumir la literatura hasta el momento sobre árboles frutales genéticamente modificados y también expone sus propios puntos de vista sobre algunas cuestiones. Si hay alguna incorrección, las críticas y correcciones son bienvenidas. Métodos de transformación de genes de plantas 1.1 Método de transformación de genes mediada por Agrobacterium
Entre los diversos métodos de transformación de genes que se han discutido hasta ahora, el método de transformación de genes de Agrobacterium es el más claramente estudiado [25]
. Este método utiliza los sistemas de ingeniería genética naturales de la naturaleza, concretamente los procesos patógenos de Agrobacterium tumefaciens y Agrobacterium rhizogenes, para transformar genes procesados artificialmente en células vegetales humanas. Granjero de cáncer de raíz
Las bacterias infectan las plantas y causan agallas en la corona. Hay dos estados de tumores coronales delgados [26]
Uno es un tumor desorganizado que prolifera en un medio libre de hormonas, pero no tiene ventaja apical y es difícil de enraizar. El plásmido relacionado con la inducción de tumores coronales delgados es el plásmido Ti (Tum.: plásmido inductor). Agrobacterium rhizogenes puede producir muchas raíces peludas en el sitio de la infección, que está relacionado con el plásmido Ri. Sólo las plantas que pueden ser infectadas por Agrobacterium pueden utilizar Agrobacterium como vector genético. Agrobacterium infecta principalmente a las dicotiledóneas. Las monocotiledóneas generalmente no son sensibles a estos dos patógenos. Sin embargo, recientemente se han producido muchos casos de infección. Las gimnospermas también pueden ser inoculadas artificialmente para causar enfermedades.
Actualmente, existen tres métodos de transformación de Agrobacterium comúnmente utilizados [
25]
(1) Infección directa de las heridas de las plantas: regerminar semillas, plantas jóvenes con un cuchillo Se hace una herida en el embrión, cotiledón o segmento de tallo, se inocula con cultivo nocturno de Agrobacterium tumefaciens, y luego se cultiva el tejido tumoral en medio libre de hormonas. Este método tiene un período experimental corto, pero a menudo existen células no transformadas en los tejidos tumorales, que pueden formar quimeras fácilmente. (2) Método de transformación del disco foliar: use una perforadora para quitar los discos foliares con un diámetro de 3 mm de hojas jóvenes y frescas, sumérjalos en Agrobacterium cultivado durante la noche durante unos segundos y luego transfiéralos al medio de cultivo 2 -3 días, luego transferir el disco foliar a un medio selectivo que contenga antibióticos para inducir la diferenciación de las plántulas, de modo que las células transformadas puedan regenerar directamente la planta. Este método es sencillo y factible, y permite obtener rápidamente plantas transgénicas. (3) Método de cultivo de protoplastos: cuando los protoplastos regeneran las paredes celulares y se dividen, su comportamiento es similar al de las células heridas de las plantas. En este momento, Agrobacterium puede infectar los protoplastos. Agregue Agrobacterium tumefaciens (1:100) a los protoplastos y cultive durante 24 a 40 h. Luego, los protoplastos se esterilizan mediante centrifugación y se cultivan en medios seleccionados para inducir la regeneración de los callos de las plantas. Debido a la homogeneidad genética de los protoplastos, las células transformadas son células individuales independientes y los transformantes obtenidos generalmente no tienen quimeras, lo que tiene un gran valor de aplicación. 1.2 Transformación directa del ADN
Debido a la limitación del rango de huéspedes de Agrobacterium, es difícil transformar los cereales, que son la parte principal de los cultivos, por parte de Agrobacterium. Por eso, en la década de 1980 se desarrolló la tecnología de introducción directa de ADN, es decir, el ADN desnudo se transfiere directamente a la planta después de un tratamiento especial.
1.2.1 Polietilenglicol: PEG)PEG) El PEG es un mediador de la fusión de protoplastos y puede afectar a la permeabilidad de la membrana plasmática. Cuando se cultivan células de ADN plasmídico, los protoplastos absorben activamente moléculas de ADN extrañas y los genes extraños pueden integrarse en el genoma de la planta para su expresión y transmisión. Después del tratamiento con PEG, una gran cantidad de protoplastos entran en contacto con moléculas de ADN y luego, bajo la acción de una solución con alto contenido de Ca ″ + y un pH alto, la carga de la membrana plasmática se redistribuye y aparecen algunos poros temporalmente variables en la superficie, y el ADN Las moléculas ingresan a los protoplastos Cuando se usa Cuando el medio de cultivo lava los protoplastos y cambia las condiciones de PEG, CaZ + alto y pH alto, los protoplastos vuelven a su forma original y las moléculas de ADN después de ingresar a los protoplastos pueden ingresar al núcleo celular. y integrarse en el núcleo celular en los cromosomas [25]
Este método es relativamente simple y fácil de operar y no requiere equipos costosos, pero requiere un sistema de preparación, cultivo y regeneración de protoplastos. /p>
1.2.2. Electroporación: Mezcle protoplastos y moléculas de ADN en un tampón, colóquelos en un recipiente pequeño para un tratamiento eléctrico de pulso alto a corto plazo, para que los poros de la membrana celular puedan restaurarse y renovarse. Se generan poros permeables (3-4 nm), lo que permite que la membrana del protoplasto entre en contacto directo con las moléculas de ADN en la célula. Actualmente, el tamaño y el número de poros reversibles en la membrana plasmática dependen de la intensidad del campo eléctrico y del tiempo de perforación. este método se limita principalmente al etiquetado de genes y tiene como objetivo establecer una transformación eficiente.
System Giant[27]
1.2.3 Método de pistola genética, también. Conocido como método de blanqueamiento parcial o microproyección de partículas de alta velocidad, es un método para transferir genes mecánicamente mediante la adición de Ca '+ y la espermidina adsorbe el ADN en la superficie de partículas de tungsteno y oro para formar microesferas de ADN, que ingresan a las células vegetales humanas. la fuerza instantánea del arma genética La mayor ventaja de este método es su amplia aplicación, la distancia de la célula objetivo, el diámetro y la velocidad del microproyectil, el radio de difusión del disparo, la cantidad y estructura del ADN exógeno y otros factores, la frecuencia de transformación es baja y. existen factores como alto precio, dificultad para eliminar quimeras, dificultad para seleccionar transformantes, etc., limitaciones
1.2.4 Además de los métodos comunes anteriores, otros métodos de transformación, como microinyección, fusión de liposomas , choque ultrasónico, electroforesis microláser, etc., se han utilizado en la transformación de genes de plantas. Tres factores que afectan la transformación genética de árboles frutales
2.2.1 Infectividad de Agrobacterium tumefaciens y la influencia de los vectores
La infectividad de Agrobacterium está directamente relacionada con la tasa de transformación y también determina el éxito o fracaso de la transformación. Uno de los factores principales La infectividad de Agrobacterium depende de las características del propio Agrobacterium y de la sensibilidad de la planta receptora. En el caso de Agrobacterium, su infectividad está relacionada con el tipo de Agrobacterium y la estructura del plásmido vector. Se puede dividir en tres tipos, a saber, tipo nopalina (Nop), tipo octopina (Oct) y tipo agrobacterium (tipo succinilo). La cepa Nop se caracteriza por un fondo cromosómico C58, una tasa de crecimiento rápida y sin formación de bolitas, y es fácil de operar. Las cepas de ingeniería de uso común incluyen C58, pGV3850, A208SE, etc. Las características de la cepa Oct son su fondo cromosómico, crecimiento lento. y nodulación durante el proceso de cultivo, lo que no favorece la operación de transformación, y * * * no son fáciles de eliminar después del cultivo. Las cepas de ingeniería comúnmente utilizadas son LBA4404 y LBA104. Las cepas de tipo Suc se caracterizan por tener un fondo cromosómico A281 o A136, característico de las cepas de tipo Nop. Las bacterias de ingeniería de uso común incluyen EHA101 y EHA105, que tienen propiedades excelentes, como un crecimiento rápido y sin formación de bolitas. Ambas son altamente infecciosas. Realizamos un estudio comparativo de la infectividad de las cepas en varios árboles frutales. Los resultados muestran que EHA105 es un sistema de vector de transformación de árboles frutales ideal. Esta cepa tiene las características de crecimiento rápido, sin formación de bolitas, fácil operación de transformación, fácil elución después del cultivo, sensibilidad a Cef, fuerte infectividad y amplia gama de huéspedes. Utilizando esta variedad hemos obtenido con éxito una variedad de plantas genéticamente modificadas como manzanas, cerezas y fresas. 2.2.2 Activación del gen vir en Agrobacterium tumefaciens
La activación del gen vir es una válvula de dominio para la transformación de Agrobacterium. La región Vir contiene 7 operones virA, b, c, d, e, f, g y h*** y 24 genes, todos los cuales desempeñan funciones reguladoras y están relacionadas con el procesamiento y la transferencia del ADN-T. La activación del gen vir juega un papel importante en la transformación de Agrobacterium, por lo que cualquier factor que pueda potenciar la activación del gen vir puede mejorar su infectividad. El inductor comúnmente utilizado del gen vir es la acetosiringona (As). Con respecto al uso de inductores, se utilizan comúnmente los siguientes tres métodos: ① Agregue AS al cultivo líquido de Agrobacterium. El tiempo de adición generalmente es de 4 a 6 horas antes de la preparación de la solución de infección bacteriana de ingeniería. (2) Agregue AS al medio de cultivo del género Agrobacterium y a los explantes. (3) Agregue AS al medio de cultivo líquido del género Agrobacterium y al medio de cultivo del género Agrobacterium. Este método parece ser el más fiable, pero se utiliza demasiado como inductor. Sin embargo, muchos experimentos han demostrado que la transformación se puede lograr sin inductores. Además, en la transformación de hojas de manzano, se encontró que la adición de betaína (lmmol/L) o prolina (lumol/L) al mismo tiempo tenía un efecto sinérgico en la activación del gen vir. Se encontró que el valor del pH tiene un impacto significativo en la activación de la zona vir.
Teóricamente, cuando el valor de pH del medio que contiene AS es de 5,0 a 5,6, la inducción genética en la región vir alcanza el nivel más alto y un cambio en el valor de pH de 0,3 tiene un impacto significativo en la tasa de transformación de muchas plantas. Las cepas de octopina y agrobactina requieren un pH más bajo que las cepas de nopalina. Normalmente, Agrobacterium tiene un pH de 7,2. Los genes virales de esta cepa virulenta están todos inactivos. El valor de pH en el medio de cultivo de tejidos vegetales suele ser 5,8, lo que favorece la activación de los genes vir. Durante el proceso de inducción de la activación del gen vir, se debe prestar atención a ajustar el valor del pH del medio de cultivo. Además, la activación de los genes vir también se ve afectada por otros factores, como la temperatura. La activación de virD y virG debe ser inferior a 28°C; también se debe agregar extracto de levadura al medio de cultivo o una alta concentración de mio-. El inositol en el medio de cultivo puede promover la expresión del gen vir.
Problemas y Contramedidas en la Investigación de Plantas Transgénicas
A través de la tecnología transgénica, podemos optimizar los rasgos agronómicos de las plantas, obtener buenos beneficios económicos y alcanzar logros significativos... Aunque como tal, Todavía existen algunos problemas potenciales en la investigación de plantas transgénicas.
Cuando se introduce en una planta un gen supresor que afecta a la actividad de las proteasas, la función digestiva de los insectos que se alimentan de sus hojas se verá perjudicada. ¿Podrían las hojas, frutos y semillas de plantas genéticamente modificadas causar daños similares a humanos y animales? ¿Qué cambios les ocurrirán a los humanos y a los animales después de que se introduzcan otros tipos de genes en las plantas? Aunque no hay evidencia directa que demuestre si las plantas genéticamente modificadas son dañinas para los humanos y los animales, y en qué medida, esta sospecha es preocupante. 3.2 Resistencia a plagas y enfermedades
La resistencia a plagas y enfermedades es un problema importante. que afecta a la producción agrícola. Investigaciones recientes muestran que si se rocía insecticida Bacillus thuringiensis de 10 a 20 veces al año, la mortalidad de la plaga se reduce en un 50% después de cinco años y su dosis de vida media aumenta 10 veces. Podría surgir una situación similar si se cultivaran a gran escala plantas genéticamente modificadas capaces de producir proteínas de la toxina del Bacillus thuringiensis por sí mismas. Además, debido a la coevolución de los organismos, las plantas resistentes pueden sobrevivir en condiciones adversas, por lo que las plagas y enfermedades desarrollarán rápidamente su adaptabilidad a hábitats adversos, provocando que las plantas transgénicas pierdan gradualmente su resistencia a las plagas y enfermedades. 3.3 Cuestiones de equilibrio medioambiental y ecológico
Después de introducir el gen objetivo en la planta, se mejoran las características de la planta. Sin embargo, si algunas plantas silvestres, especialmente algunas malezas, capturan estos genes, se producirán algunos tipos nuevos de malezas. Por ejemplo, los herbicidas ya no son eficaces para matar las malas hierbas que tienen genes resistentes a los herbicidas. Si las malezas capturan genes de resistencia al estrés, se mejorará su capacidad para adaptarse al medio ambiente y su competitividad de supervivencia, intensificando así su proliferación y propagación. Algunas especies de plantas raras se extinguirán debido al reemplazo competitivo, la diversidad genética de la misma planta se reducirá y las comunidades de insectos también se verán afectadas.
Aunque la investigación sobre modificaciones genéticas ha provocado los problemas mencionados anteriormente, a medida que la investigación se profundice, la gente buscará nuevas contramedidas para resolver estos problemas. Deberíamos fortalecer la gestión de la investigación genéticamente modificada a través de legislación y otros medios para minimizar el impacto negativo de la investigación genéticamente modificada. A través del tiempo, el espacio, el aislamiento genético y otros medios, es básicamente posible controlar la propagación de genes vegetales y reducir su daño al medio ambiente ecológico.
Perspectivas de la tecnología transgénica
La introducción de genes extraños en el ADN genómico de las células receptoras de forma específica y cuantitativa para obtener nuevos individuos con expresión y herencia estables y eficientes es el principal objetivo de Objetivo de investigación transgénica. A medida que se acelera la industrialización de la biotecnología, la tecnología genéticamente modificada desempeñará un papel cada vez más importante.
(1) Utilice la transformación multigénica para cultivar nuevas variedades súper resistentes a los insectos. Muchos virus, hongos, bacterias y plagas no solo causan enormes pérdidas económicas a la producción de árboles frutales, sino que también causan contaminación ambiental debido a. el uso extensivo de pesticidas. Se han clonado muchos genes resistentes a insectos, como cp, bt, icp, cpti, péptidos antimicrobianos, quitinasa, lectina del loto de las nieves, genes PRP, etc. , sentando las bases para cultivar nuevas variedades resistentes a enfermedades, pero estos genes son muy específicos y sólo pueden ser eficaces contra cierto tipo de enfermedades y plagas de insectos. En los últimos años, un avance importante en la ingeniería genética vegetal es la construcción de vectores cromosómicos artificiales, el establecimiento de sistemas de transformación multigénica y la realización de transformación multigénica. Estos nuevos desarrollos sientan las bases para introducir muchos tipos diferentes de genes resistentes a los insectos en árboles frutales y también abren nuevas formas de generar variedades súper nuevas con resistencia general a los insectos.
(2) Utilizar la ingeniería genética para cultivar nuevos portainjertos. El cultivo de nuevos portainjertos para árboles frutales es un tema de investigación importante. La resistencia al estrés, el enanismo, el alto rendimiento y la capacidad de enraizamiento de los árboles frutales están relacionados con los portainjertos. Actualmente existen muchos genes de resistencia al estrés, genes de hormonas de enraizamiento, genes de enanismo, etc. La introducción de estos genes en portainjertos existentes promoverá eficazmente el desarrollo de la industria de los árboles frutales. Además, el mejoramiento mediante ingeniería genética por portainjertos casi no presenta problemas de seguridad relacionados con los transgénicos y es fácilmente aceptado por la sociedad.
(3) Utilizar la manipulación de genes antisentido para generar nuevas variedades resistentes al almacenamiento. Según el principio del ARN antisentido, los genes antisentido se construyen artificialmente, se introducen en las células para expresar secuencias parciales que son complementarias al ARNm objetivo y luego se emparejan con ellos para formar un complejo, bloqueando así el flujo de información del ADN del ARN a la proteína. y regular la expresión del gen diana. La aplicación de la tecnología de manipulación de genes antisentido en la ingeniería genética vegetal ha logrado resultados gratificantes.
(4) Mejorar la calidad del fruto. Hasta el momento se han clonado muchos genes relacionados con la calidad del fruto. Si estos genes se introducen en los árboles frutales, como los genes de la polisacárido sintasa, los genes de la trehalosa sintasa, los genes de la proteína dulce, la lisina y otros genes de la aminoácido sintasa esencial, se cultivarán nuevas variedades de alta calidad.