¿Alguien puede explicar en detalle todo el proceso de secuenciación del genoma?

La secuenciación directa es un método basado en MSP para estudiar más a fondo la metilación de la isla CpG. Los sulfitos desamidan la citosina no metilada del ADN a uracilo, mientras que la citosina metilada permanece sin cambios. Después de la amplificación por PCR (evite CpG tanto como sea posible en el diseño del cebador para evitar verse afectado por factores de metilación), todo el uracilo se convierte en timina. Finalmente, se secuencian los productos de la PCR. En comparación con la secuencia no procesada, se puede determinar si el sitio CpG está metilado. Este método es un método altamente confiable y preciso que puede determinar el estado de metilación de cada sitio CpG en el fragmento objetivo. Ventajas incomparables a la hora de encontrar sitios CpG clave y significativos. El método de secuenciación utiliza una secuencia sin puntos CpG en ambos lados de la isla CpG como región de emparejamiento de cebadores. Por lo tanto, las secuencias diana metiladas y no metiladas pueden amplificarse simultáneamente. Su desventaja es que requiere mucho tiempo y es caro. Para obtener datos fiables, es necesario secuenciar al menos 10 clones. Requiere una gran cantidad de clonación, extracción y secuenciación de plásmidos, lo cual es un proceso tedioso y costoso.

La primera parte es la extracción del ADN genómico.

No hay suspenso sobre este paso. Puedes comprar un kit de extracción de ADN de células o tejidos. Si las condiciones del laboratorio son maduras, puedes extraerlo tú mismo. El ADN es relativamente estable. Mientras no se utilice violencia durante la cirugía, el ADN genómico resultante debe estar intacto.

El foco de este paso está en la pureza del ADN, es decir, es muy importante reducir o evitar la contaminación del ARN y la proteína, por lo que se debe utilizar proteinasa K y ARNasa para eliminarlo durante la extracción. proceso.

Información detallada sobre el uso de ambos:

1: La proteinasa K se puede formular con agua bidestilada esterilizada a 20 mg/ml;

2.La ARNasa debe RNasa libre de DNasa formulada, es decir, después de comprar RNasa en el mercado, prepararla a 10 mg/ml. De lo contrario, la posible consecuencia es que no sólo no hay 2:ARN, sino que el ADN también se digiere. Ambos se almacenaron a -20°C.

Existen dos métodos para verificar la pureza del ADN extraído:

1: Calcular el ratio OD con un espectrofotómetro UV;

2: 1%- Electroforesis en gel de agarosa al 1,5%.

Prefiero el segundo método, que puede aclarar completamente la pureza del ADN genómico propuesto y estimar su concentración en función del tamaño de muestra etiquetado para la siguiente modificación.

La segunda parte es la modificación del ADN genómico mediante bisulfito de sodio

A menos que se indique lo contrario, todo el DDW fue esterilizado mediante vapor a alta presión.

1: Diluir aproximadamente 2 microgramos de ADN en 50 microlitros; agregar DDW a un tubo EP de 1,5 ml.

2: Agregar 5,5 ul de NaOH 3 M recién preparado;

3: baño de agua a 42 ℃ durante 30 minutos;;

Trabajo de preparación durante el baño de agua:

4: 10 mm de hidroquinona, agregue 30 ul a la solución mezclada después del agua baño (la solución se vuelve (se vuelve amarilla clara)

5: bisulfito de sodio 3,6 m (Sigma, S9000), método de preparación: se diluyen 1,88 g de bisulfito de sodio con DDW, se titula a PH 5,0 con NaOH 3 M, y el volumen se ajusta a 5ml. Es difícil disolver el bisulfito de sodio en una concentración tan grande, pero se disolverá lentamente después de agregar NaOH, por lo que se requiere paciencia. El pH debe ser exactamente 5,0. Después del baño de agua, añadir 520 µl a la solución anterior.

6: Se envuelve el tubo EP en papel de aluminio para protegerlo de la luz y se invierte la solución suavemente.

7: Añadir 200 ul de aceite de parafina para evitar la evaporación del agua y limitar la oxidación.

8: Baño de agua negra a 50℃ durante 16h.

Normalmente este paso comienza a las 4 de la tarde, y si eres hábil, podrás completarlo antes de las 5 de la tarde. El baño de agua de las 16 h se realizó poco después de las 8 en punto de la mañana siguiente, lo cual fue muy adecuado.

Detalles de este paso:

1: No es necesario que la cantidad de ADN genómico sea muy precisa, más bien más que menos, ya que se perderá en posteriores pasos de purificación y recuperación. Este método se puede modificar hasta 4ug.

2. Todos los reactivos deben estar recién preparados, por lo que la técnica de preparación de la solución debe ser la adecuada, rápida y precisa.

3. La solución de bisulfito de sodio es fuertemente ácida y el valor del pH debe ajustarse a 5,0 con álcali; de lo contrario, un valor de pH inadecuado afectará la purificación y absorción posteriores.

4. El mejor baño de agua es de 16 horas. Aunque se puede reducir a 8 horas, las modificaciones posteriores no serán exhaustivas.

La tercera parte es la purificación y recuperación del ADN modificado

A menos que se especifique lo contrario, los tubos EP se esterilizan mediante autoclave.

1. Coloque la punta de la pipeta debajo de la capa de aceite de parafina, primero presurice suavemente para expulsar una pequeña sección de aceite de parafina y luego succione la mezcla en un tubo EP limpio de 1,5 ml.

2. Utilice el asistente de Promega para limpiar el sistema de purificación y recuperación de ADN (Promega, A7280).

1) Precaliente DDW en un baño de agua a 70 ℃; Prepare alcohol isopropílico al 80%.

2) Agregue 1 ml de resina limpiadora Wizard DNA de Promega, invierta suavemente y mezcle uniformemente para obtener la mezcla. ADN completamente combinado con la resina;

3) Dado que el kit solo viene con una jeringa y sin tapón de aguja, si hay un aspirador de presión negativa al vacío, es muy conveniente de usar; si no, lo necesita; para preparar su propia jeringa de 3ml-5ml. Después de que el cilindro de la jeringa esté firmemente conectado a la columna de recuperación proporcionada en el kit, use una pipeta para mover la mezcla anterior a la jeringa y coloque un tubo EP de más de 2 ml debajo de la columna para recibir el líquido residual. Añade el tapón de la aguja y presiona suavemente para exprimir el líquido. En este punto, se ven depósitos de resina blanca en la columna.

4) Después de separar la jeringa del cartucho, extraiga el pasador, luego conecte la jeringa al cartucho, agregue 2 ml de alcohol isopropílico al 80 % a la jeringa, inserte el pasador, presione suavemente y apriete. alcohol isopropílico. Este es el paso de lavado.

5) Separe la jeringa del cartucho, coloque el cartucho en un tubo EP limpio de 1,5 ml y centrifugue a 12000 rpm durante 2 minutos para eliminar el alcohol isopropílico residual y secar la resina. En este momento, el ADN modificado está unido a la resina.

6) Saque la columna y colóquela en otro tubo EP limpio de 1,5 ml, agregue 50 μl de DDW precalentado a la pipeta y déjela a temperatura ambiente durante 5 minutos.

7) Centrifugar a 12.000 rpm durante 20 segundos. Este es el paso de elución. En este momento, el líquido en el tubo EP es la solución de ADN modificado eluida con un volumen final de 50 ul.

3: Añadir 5,5 μl de NaOH 3M recién preparado y colocarlo a temperatura ambiente durante 65.438±05 minutos.

4: Añadir 33ul de acetato de amonio 10M para neutralizar el NaOH y llevar el valor de pH de la solución a aproximadamente 7,0.

5. Añadir 4U10 mg/ml de glucógeno como indicador de precipitación, debido a que puede producir precipitación después de mezclar con etanol, lo que facilita la identificación de la ubicación del producto recuperado después de la centrifugación y evita que el producto recuperado se desprenda. absorbido al absorber el etanol residual. De hecho, es difícil decir cuánto efecto pueden tener estos glucógenos. Sin embargo, hay a la venta glucógeno de producción nacional, el envase no es grande y es muy barato. Al comprar, debe seguir estrictamente los pasos indicados en la literatura.

6: Añadir 270ul de etanol absoluto helado, colocar a -20°C y dejar reposar durante la noche. Algunas personas piensan que el tiempo de asentamiento más corto puede ser de 2 horas, pero yo creo que puede llevar más tiempo. Al realizar este paso, suele durar hasta el mediodía. Si hay muchas muestras, puede ser mejor dejarlas durante la noche, así el horario se puede relajar y, por cierto, puedes hacer otros experimentos. Si quieres terminarlo el mismo día no hay problema, pero creo que es mejor asentarlo en un tiempo largo, al menos 6 horas.

7:4, centrifugar a 12.000 rpm durante 30 minutos, verter el sobrenadante y recoger el precipitado. No es necesario absorberlo por completo.

8: Añadir 500ul 70% etanol 70%. No hacer estallar el precipitado, solo añadir etanol. Incline suavemente el tubo EP, gire una vez y centrifugue nuevamente a 12.000 rpm a 4 grados durante 5 minutos. Después de la centrifugación, eliminar el sobrenadante, añadir una cantidad igual de etanol y hacerlo de nuevo. Este es un paso de lavado, * * * dos veces.

9: Verter el sobrenadante, centrifugar brevemente a temperatura ambiente, separar el etanol adherido al fondo del tubo EP, absorber cuidadosamente el líquido residual con una pipeta, secar a temperatura ambiente durante 5 minutos, o déjelo reposar. Cuando cambie de opaco a translúcido o transparente, agregue 20ul-30ulDDW para disolver el precipitado. Hasta ahora, se ha completado la purificación y recuperación del ADN modificado y la solución de ADN modificado se puede utilizar para futuros experimentos.

10: Almacene la solución de ADN a -20 ℃.

Detalles de este paso:

1: Al usar la jeringa, la fuerza debe ser uniforme y ligera. Si se utiliza fuerza, la membrana de la columna quedará aplastada y quedará inservible.

2. No es necesario preparar el acetato de amonio y el glucógeno recién hechos. Una vez preparado el azúcar sin refinar, se debe almacenar a -20 °C. El acetato de amonio se puede almacenar a temperatura ambiente porque el acetato de amonio a esta concentración es muy insoluble. Una vez colocado a 4°C, una gran cantidad de soluto precipitará cuando se extraiga.

3: No es necesario preparar alcohol isopropílico y etanol al 70% recién preparados, pero si la dosis es grande, es conveniente prepararlos in situ.

La clave de este paso es la combinación de resina y ADN, lo que vuelve a enfatizar la importancia de ajustar el valor del pH del sulfito de sodio en la segunda parte. Debido a que la combinación de resina y ADN requiere un valor de pH adecuado, si el paso anterior no se hace bien, la resina no podrá combinarse bien con el ADN en este paso, lo que traerá consecuencias desastrosas, es decir, el ADN y el líquido se perderán. Se exprimen juntos y el lavado. En realidad, no hay ADN cuando se lo quita.

La cuarta parte del ADN modificado se utiliza para la PCR.

No hay suspenso sobre este paso. Aquí hablaré principalmente sobre algunos temas espinosos:

1: Problema con el cebador: parece muy difícil diseñar cebadores usted mismo. Diseñé varios pares de cebadores y los probé, pero todos fracasaron. Si tengo suficiente tiempo y no hay muchos documentos genéticos relativamente nuevos, no sería ningún problema para mí diseñar mis propios cebadores. Si no, es mejor consultar la literatura. Primero consulte la literatura con puntuaciones altas de SCI y luego la literatura de laboratorios famosos. Sería mejor tenerlo en China. Puede contactarnos directamente para realizar consultas. Después de encontrar la secuencia, asegúrese de compararla con la secuencia en Genbank para evitar diferencias de bases individuales causadas por errores tipográficos.

Luego puedes buscar en Google para ver si hay muchos usuarios y las condiciones del sistema son las mismas. Hay muchos usuarios y las mismas condiciones del sistema, lo que indica una fuerte repetibilidad. También actué en consecuencia y todo salió relativamente bien.

2. Problema de la enzima Taq: parte de la literatura utiliza Taq (platino) con medalla de oro de alta fidelidad, pero creo que siempre que el sistema sea correcto y las condiciones como la desnaturalización y el recocido sean apropiadas, el calor normal. -Las enzimas de inicio siguen siendo aceptables. Comencé a usar LA Taq de Takara, que funciona muy bien y viene con un buffer LA 10x, que contiene mg++. A veces, cuando se te acaba, puedes usar temporalmente la enzima Taq normal de Takara. ¿Cómo elegir?

3. Condiciones de PCR: la desnaturalización es generalmente de 95 grados, 3 m durante 3 minutos. Siento que el resto se basa en la literatura. El recocido se puede probar en un rango pequeño según la temperatura de recocido de la imprimación. Generalmente no hay mucha diferencia con los informes de la literatura. Esto es sólo una cuestión de especificidad de los fragmentos amplificados. Se recomienda seguir la literatura.

4. Es mejor elegir tubos EP importados para PCR. La pared del tubo es delgada y el grosor es uniforme, lo que puede garantizar que los cambios rápidos de temperatura se puedan transmitir a la solución de reacción en el tubo a tiempo. , para que el sistema pueda funcionar realmente a la temperatura establecida.

5. Instrumento de PCR: Si se realiza en un determinado instrumento, lo mejor es utilizar siempre este instrumento. Los diferentes instrumentos tienen diferentes niveles de calor, pero el tubo EP debe estar bien conectado al enchufe del instrumento, dejando un espacio, creo que afectará la transferencia de temperatura.

Esta parte es un poco larga, solo una experiencia personal inmadura. Si tienes alguna duda, por favor indícala y comunícate. Vine aquí primero hoy y actualmente estoy escribiendo contenido, lo cual es bastante laborioso y no se puede hacer de la noche a la mañana. Por favor, perdóname. Me tomé un descanso y me preparé para escribir la última parte del clon de detección de puntos azules y blancos.

La quinta parte es la recuperación en gel de los productos de PCR.

Este paso es relativamente sencillo. Puede comprar kits de recuperación de productos de PCR en gel, que se producen en el país y tienen un precio razonable, como los productos Tiangen (de segunda mano). Siga las instrucciones.

Algunos detalles:

1: La solución de electroforesis recién preparada debe usarse para la electroforesis en gel de agarosa de productos de PCR. La concentración del gel puede ser del 1% al 2%.

2. Al recuperar el ADN del gel, observe la posición de la banda bajo luz UV de 300 nm y corte el gel donde se encuentra el fragmento objetivo lo más pequeño posible para garantizar la especificidad.

3. El tiempo de irradiación ultravioleta no debe ser demasiado largo, de lo contrario dañará el ADN.

4. Si el ADN recuperado no se utiliza inmediatamente, se almacenará a -20°C y será muy estable al cabo de varios meses.

La sexta parte es la ligación y transformación de productos de PCR con vectores T y el cribado de manchas azules y blancas.

1: Ligadura del vector T (este experimento utiliza el kit de Promega)

Sistema 15ul

T-easy 1ul

Ligasa 1ul

2x buffer 7.5ul

ADN 5.5ul microlitro

4 grados durante la noche.

2. Transformación del producto de ligación

1) Sacar las bacterias competentes del frigorífico a -70°C, descongelar y colocar en hielo

; 2) Ligadura Agregar los 15ul del producto y mantener en hielo durante 30 minutos

3) 42 grados durante 90 segundos

4) Colocar en hielo durante 2 minutos

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5) 800ul de medio de cultivo LB;

6) 280 rpm, 37 grados, agitar durante 45 minutos (drenar el tubo de ensayo y agitar bien para asegurar que la solución bacteriana se agite uniformemente);

7) 8000 rpm, 1 minuto; retirar el sobrenadante en la mesa ultralimpia, dejando 100-150 ul;

8) Recubrimiento: incubar a 37 grados durante la noche (la placa; es un medio LB sólido que contiene ampicilina)

Primera capa: o manchas blancas. Tomando como ejemplo los puntos blancos, especialmente los puntos blancos alrededor de los puntos azules, la tasa de autoenlace es baja.

3. Coge algunos puntos blancos y planifícalos en el nuevo tablero.

Nueva placa de circuito: primero pintar: X-gar 35ul

IPTG 25ul

Luego dibuja una partición en la parte inferior de la placa y márcala. Dependiendo de las necesidades, generalmente no supone ningún problema realizar 50 clones en una placa.

La aguja selecciona el punto blanco y marca 2 carriles en la zona correspondiente de la placa.

37 grados, toda la noche en una incubadora.

4. Contactar con la empresa secuenciadora para enviar la secuenciación. Generalmente, un clon cuesta entre 35 y 45 yuanes.

Detalles de esta parte:

1: El recubrimiento debe ser uniforme y Xgar e IPTG deben distribuirse uniformemente en el tablero.

2. deja que el azul Las manchas blancas estén demasiado crecidas; de lo contrario, sería fácil seleccionar dos clones a la vez.