Cómo reducir y evitar los dímeros de cebador
1 A partir del cebador en sí, rediseñar el cebador es la forma más fundamental de resolver este problema.
2 También puede haber un problema con la concentración de la plantilla; pequeño, aumente adecuadamente la cantidad de plantilla;
3. Las concentraciones de la enzima Taq, los cebadores y el Mg2 pueden ser demasiado altas y sus concentraciones pueden reducirse
4. Los cebadores ascendentes y descendentes que desee agregar, hiérvalos en agua hirviendo a 100 grados Celsius durante 5 minutos, luego sáquelos rápidamente y colóquelos en hielo para enfriarlos instantáneamente. Luego agréguelos al sistema de reacción. desaparecerá; razón: la imprimación puede tener una estructura de horquilla y en sí misma. Para estructuras como la ciclación, hervir en agua hirviendo a 100 grados Celsius durante 5 minutos puede convertir la imprimación en una sola hebra para reducir los dímeros. Sin embargo, algunas personas creen que la desnaturalización a 95 grados durante 5 minutos en una máquina de PCR también puede lograr el objetivo, y han intentado eliminar con éxito los dímeros de cebador ampliando el tiempo de hibridación.
5. Agregar 5% de glicerol o 5% de DMSO a la MEZCLA preparada puede mejorar la especificidad.
6 La preparación del sistema de reacción de PCR se realiza en hielo, y finalmente. Se agrega la enzima TAq, una vez completada la PCR, no deje el producto a temperatura ambiente por mucho tiempo. Algunas personas piensan que algunas enzimas TAQ sintetizarán el exceso de cebadores en dímeros a temperatura ambiente.
7. Aumentar el número de ciclos;
8. Si hay bandas después de bajar la temperatura de recocido, se debe aumentar la temperatura gradualmente si la cantidad de producto disminuye. temperatura, considere agregar una concentración de iones de magnesio (dependiendo de la longitud del fragmento amplificado, cuanto más largo sea el fragmento, la concentración de iones de magnesio correspondiente debe ser mayor);
9. Se descubre que todavía solo hay dímeros de cebador y la concentración de iones de magnesio está entre 20 y 25 mmol/l. Si no hay diferencia entre 20 y 25 mmol/l, se considera que los reactivos como el tampón no están completamente derretidos y mezclados, lo que da como resultado un resultado incorrecto. concentración de los reactivos extraídos.
10. Usar el último producto de la PCR como plantilla para una segunda PCR puede mejorar la especificidad de los cebadores y las plantillas y reducir los dímeros de los cebadores. Si el intervalo de tiempo entre los dos tiempos es corto, se puede utilizar el producto original. diluido 100-1000 veces, si el intervalo es más largo, se puede diluir 50-100 veces;