Pasos, requisitos y precauciones específicos para el cultivo celular
1. Recuperación celular
Después de sacar las células congeladas del nitrógeno líquido, agítelas continuamente en un baño de agua a 37°C para favorecer su fusión. Transfiera a un tubo de centrífuga de 15 ml, agregue 10 ml de medio de cultivo completo DMEM precalentado, sople suavemente de manera uniforme, centrifugue a 2000 rpmX2 min, deseche el sobrenadante.
Añadir 10ml de medio DMEM para lavado y desechar el sobrenadante. Añadir 10 ml de medio completo DMEM, pipetear suavemente, inocular en una placa de 10 cm y cultivar en una incubadora de cultivo celular que contenga 5 CO2.
2. Paso celular
Cuando la densidad celular alcanza 80~90. Retire el medio de cultivo y lave dos veces con 10 ml de PBS. Agregue 3 ml de tripsina que contenga 0,25 EDTA y colóquelo en la incubadora de células durante 3 minutos. Agregue 1 ml de medio completo DMEM para detener la digestión con tripsina y transfiéralo a un tubo de centrífuga de 15 ml.
Añadir 10ml de PBS para limpiar la placa de cultivo celular, transferir a un tubo de centrífuga de 15ml, 2000rpmX2min, desechar el sobrenadante. Luego agregue 10 ml de PBS (esterilizado en autoclave y almacenado a 40 ° C), sople uniformemente, extraiga 10 l para contar, inocule 1 × 106 / placa y continúe cultivando en una incubadora de cultivo celular que contenga 5CO2.
3. Criopreservación celular
Cuando la densidad celular alcance 80 a 90, retirar el medio de cultivo y lavar dos veces con 10 ml de PBS. Agregue 3 ml de tripsina que contenga 0,25 EDTA y colóquelo en la incubadora de células durante 3 minutos. Agregue 1 ml de medio completo DMEM para terminar la digestión con tripsina y transfiéralo a un tubo de centrífuga de 15 ml. Agregue 10 ml de PBS para limpiar la placa de cultivo celular, transfiéralo a un tubo de centrífuga de 15 ml, 2000 rpmX2 min, deseche el sobrenadante.
Agregue 1 ml de solución de congelación (90% de suero, 10DMSO), colóquelo en la caja de congelación (hay alcohol isopropílico en la caja para garantizar la velocidad de reducción de la temperatura) y colóquelo inmediatamente en un recipiente a 80 ℃. Déjelo en el refrigerador y colóquelo en nitrógeno líquido al día siguiente. Se puede almacenar durante al menos dos años. Si no se coloca en nitrógeno líquido, se puede almacenar durante tres meses.
Preparación de la solución de criopreservación: se debe agregar gota a gota lentamente medio completo al 70 %, 20 FBS, 10 DMSO, agitando mientras se deja caer.
Notas
(1) Al ingresar a la sala de células para iniciar el cultivo celular, se deben seguir estrictamente los siguientes pasos:
① Determinar todas las soluciones para la manipulación celular y los consumibles han sido esterilizados y probados sin problemas. No utilice soluciones ni consumibles de los que no esté seguro, a menos que existan circunstancias especiales, no tome prestadas soluciones de otras personas.
② Asegúrate de que los puños de tu ropa estén arremangados o los puños de tu bata blanca estén bien atados.
③ Determine la cantidad de alcohol en la lámpara de alcohol y rellénela a tiempo si es necesario.
④ Asegúrese de que todas las soluciones y consumibles necesarios estén al alcance de la mano. Para facilitar la apertura de las tapas de las botellas con una mano, todas las tapas de las botellas se pueden aflojar antes de que comience el experimento.
⑤Procura no verter la solución directamente a menos que no se queme la boca de la botella. Si no se puede verter y la solución se pega a la boca de la botella, use una toalla de papel rociada con alcohol al 75 % para limpiar cuidadosamente alrededor de la boca de la botella (no toque la boca de la botella) y luego simplemente quémela en un llama.
⑥Si no está seguro de que los consumibles utilizados estén limpios durante el funcionamiento, deben reemplazarse a tiempo.
⑦ Limpiar a tiempo después del experimento, mantener el área de trabajo limpia y ordenada y finalmente limpiar la mesa con alcohol al 75%.
(2) Prevención de la contaminación celular
①Prevenir la contaminación de los suministros experimentales. Los reactivos, consumibles y equipos utilizados en el cultivo celular deben limpiarse y desinfectarse a fondo, y varias soluciones deben esterilizarse cuidadosamente y solo pueden usarse después de una prueba de esterilidad negativa. El quirófano y el resto del equipo esterilizado deben limpiarse, desinfectarse y esterilizarse periódicamente.
②Evita la contaminación durante el proceso de operación.
③ El uso de ropa que genere fácilmente electricidad estática o absorba polvo debe cambiarse por una bata blanca antes de ingresar al espacio de la celda.
④ Antes de comenzar el experimento, debe asegurarse de que los guantes que está usando estén bien. Siempre que haya entrado en contacto con elementos fuera del gabinete de seguridad biológica, los guantes deben desinfectarse a tiempo. .
⑤Cierre la puerta después de ingresar a la sala de cultivo celular, siéntese y muévase lo menos posible para evitar afectar la cortina de viento de la cabina de seguridad biológica. Antes de comenzar a trabajar, limpie las manos y las tapas de las botellas con 75 bolas de algodón con alcohol. Verifique estrictamente el equipo, las soluciones y las celdas utilizadas con anticipación. No introduzca contaminantes ni artículos no esterilizados en la sala esterilizada, y mucho menos los utilice de manera informal para evitar una contaminación a gran escala.
⑥Sea cuidadoso al operar las celdas. Debe abrir la boca de la botella en un área estéril alrededor de la llama, colocar la boca de la botella alrededor de la llama y simplemente girarla para quemar. Tenga cuidado de no dejar que la llama queme. boca de botella de plástico.
⑦ Durante las operaciones experimentales, las particiones del gabinete de bioseguridad se deben bajar tanto como sea posible y se deben minimizar las conversaciones. Al estornudar o toser, nunca mirar hacia el área de trabajo para evitar una contaminación innecesaria.
⑧La tapa de la botella debe colocarse boca abajo y lejos de usted para evitar que se contamine por un mal uso.
⑨No pasar por la boca de un recipiente abierto para evitar la contaminación de las células por la caída de objetos desconocidos sobre la ropa.
⑩ Durante las operaciones experimentales, preste atención a reemplazar las pipetas Pasteur, las puntas de las pipetas y las pipetas a tiempo, y no utilice una tubería hasta el final. Una vez que descubra que ha entrado en contacto con elementos que no están limpios o cuya limpieza no se puede determinar, deberá desecharlos directamente. Después del experimento, debes limpiar a tiempo, mantener el laboratorio limpio y ordenado y finalmente limpiar la mesa con alcohol al 75%.
(3) Prevenir la contaminación cruzada celular
① Al realizar diversas operaciones de cultivo celular, el equipo utilizado debe distinguirse estrictamente y es mejor marcarlo para una fácil identificación. Realice operaciones en secuencia y solo procese un tipo de celda a la vez. Cuando se realizan múltiples operaciones en varias celdas al mismo tiempo, puede ocurrir fácilmente el caos.
② Al realizar operaciones de reemplazo o paso del medio, las puntas de pipeta y las pipetas con células adheridas no deben tocar la boca de la botella de reactivo para evitar introducir células en el medio de cultivo y contaminar otras células.
③ Una vez que todas las células se compran, importan de otro lugar o las establece usted mismo, deben conservarse y congelarse a tiempo. Una vez que se produce la contaminación, las células se pueden reanimar y cultivar.
Información ampliada:
El cultivo celular (cultivo celular) se refiere a la simulación del medio interno (esterilidad, temperatura adecuada, pH y determinadas condiciones nutricionales, etc.) in vitro para permitirle sobrevivir, crecer y Un método para propagar y mantener la estructura y función primarias. El cultivo celular también se denomina tecnología de clonación celular y el término formal en biología es tecnología de cultivo celular.
Ya sea para toda la tecnología de bioingeniería o para una de las tecnologías de clonación biológica, el cultivo celular es un proceso esencial. El cultivo celular en sí es la clonación de células a gran escala. La tecnología de cultivo celular puede transformar una célula en una sola célula simple o en varias células con una diferenciación mínima a través de una gran cantidad de cultivo. Esta es una parte esencial de la tecnología de clonación, y el cultivo celular en sí es la clonación de células.
La tecnología de cultivo celular es una tecnología importante y comúnmente utilizada en los métodos de investigación de biología celular. A través del cultivo celular, se puede obtener una gran cantidad de células y también se puede obtener la transducción de señales celulares, el anabolismo celular y el crecimiento celular. Proliferación estudiada, etc.
Referencia: Enciclopedia Baidu: Cultivo Celular