¿Cómo se extraen las proantocianidinas?
Método de extracción y detección de proantocianidinas de semilla de uva
1 Concepto, propiedades y seguridad de las proantocianidinas de semilla de uva
1.1 Concepto de proantocianidinas
Las investigaciones muestran que la única sustancia proantocianidina en las semillas de uva es la proantocianidina [21. La definición de proantocianidinas no es uniforme. Las proantocianidinas reciben su nombre porque producen antocianinas rojas cuando se calientan en medios ácidos3. Sin embargo, los monómeros de catequina reaccionan sin antocianinas en condiciones ácidas calientes, por lo que los monómeros de catequina no deben clasificarse como proantocianidinas. Este concepto también ha sido reconocido por el Comité Estadounidense de Evaluación del Método de Semillas de Uva y por las principales empresas nacionales que producen extracto de semilla de uva. Las proantocianidinas de semillas de uva están compuestas de catequina, epicatequina y sus ésteres de ácido gálico a través de C4-C o C4-C. Es un polímero compuesto por enlaces enlazados y valentes. La fórmula estructural general se muestra en la Figura 15J. Los dímeros a tetrámeros generalmente se denominan oligómeros (OPC), y los pentámeros y superiores se denominan polímeros.
R=3p-OH catequina, R=3p-O-galato catequina O-galato R-3a-OH epicatequina. O-galato de epicatequina R-3a-O
Figura 1 La estructura y unidades constituyentes de las proantocianidinas
1.2 Las principales propiedades de las proantocianidinas
Las proantocianidinas pueden producir antocianinas rojas en condiciones cálidas y ácidas. Esta propiedad se puede utilizar para el análisis cualitativo y cuantitativo de proantocianidinas. Hay más grupos hidroxilo en la estructura y mayor polaridad, lo que lo hace bien soluble en solventes polares como agua, metanol, acetona y etanol, pero no soluble en sustancias no polares como benceno, cloroformo y éter de petróleo. La mayor cantidad de estructuras de hidroxilo también lo convierten en un buen donante de átomos de hidrógeno y tiene fuertes propiedades antioxidantes. Los estudios han demostrado que entre 0:1, ·OH y ·CH, las proantocianidinas tienen la mejor capacidad de eliminación para 0:1, y en el rango de grado de polimerización entre 2 y 5, el efecto aumenta con el aumento del grado de polimerización. El análisis de la relación estructura-actividad muestra que las proantocianidinas con grupos galoilo tienen una actividad antioxidante más fuerte y la actividad antioxidante de los dímeros es más fuerte que la de las catequinas monoméricas. El dímero unido a cc tiene una actividad antioxidante más fuerte que el dímero unido a cc. La longitud de onda de absorción máxima de las proantocianidinas es cercana a los 280 nm, lo que le confiere una gran capacidad de absorción de rayos UV. Las principales propiedades anteriores hacen que las proantocianidinas sean muy adecuadas para el desarrollo de alimentos y cosméticos saludables.
13 Seguridad de los productos de proantocianidina
El Grupo de Investigación de Proantocianidina de Semilla de Uva de la Universidad de Creighton en Estados Unidos y la Agencia de Protección Ambiental de Estados Unidos realizaron conjuntamente un estudio sobre el extracto de proantocianidina de semilla de uva de acuerdo con el Manual de pruebas de efectos sobre la salud del Reglamento de control de sustancias tóxicas (GSPE) para una serie de estudios de toxicidad y bioeficacia. Los resultados demuestran que GSPE tiene una alta seguridad y buenas capacidades antioxidantes y de eliminación de radicales libres8. El académico japonés Yamakoshi y otros también utilizaron una serie de pruebas toxicológicas para confirmar que el extracto de semilla de uva rico en proantocianidinas es altamente seguro. Puede usarse para el desarrollo de alimentos funcionales.
2 Métodos de extracción de proantocianidinas
Los métodos comúnmente utilizados para extraer proantocianidinas incluyen la extracción con agua, la extracción con agua y solventes orgánicos y la extracción asistida por instrumentos. . Las sustancias proantocianidinas de las semillas de uva suelen estar combinadas con proteínas y celulosa en estado ligado fl01, que generalmente es difícil de extraer. Suele extraerse con disolventes orgánicos o agua, que tiene el efecto de romper los enlaces de hidrógeno. Al mismo tiempo, debido a la escasa permeabilidad de los disolventes orgánicos, generalmente no se utilizan solos y a menudo requieren agua como agente de transferencia de masa.
2.1 Método de extracción con agua
Masquelier~l-Nengzao obtuvo proantocianidinas de corteza de pino mediante extracción cruda con agua hirviendo y purificación con acetato de etilo. Cuando se utiliza agua como agente de extracción, la extracción lleva mucho tiempo y la temperatura es alta, lo que puede provocar fácilmente la pérdida de proantocianidinas. Al mismo tiempo, el agua es más polar y disuelve más impurezas.
2.2 Método de extracción con disolvente orgánico y agua
El metanol, la acetona, el etanol y el acetato de etilo son disolventes orgánicos comúnmente utilizados para extraer proantocianidinas de semillas de uva. Tienen buenas propiedades de disolución de proantocianidinas. la polaridad es grande II, y el orden de Jt~ es metanol>etanol>acetona>acetato de etilo. El etanol es un disolvente de extracción de uso común, barato y abundante. Los componentes de proantocianidinas extraídos con acetato de etilo tienen buena actividad biológica, pero debido a la baja polaridad, la extracción de proantocianidinas es incompleta. Las soluciones acuosas de metanol y acetona (50 % a 75 %) tienen un buen rendimiento de extracción de proantocianidinas y también se utilizan a menudo como disolventes de extracción para determinar el contenido de proantocianidinas. Xiong He-21 comparó los efectos de extracción de soluciones acuosas de metanol, etanol y acetona sobre polifenoles. Los resultados mostraron que la solución acuosa de acetona al 70% era el mejor disolvente. La razón del buen efecto de extracción de la solución acuosa de acetona: las moléculas de proantocianidina contienen múltiples anillos de benceno y enlaces éter, son altamente solubles en aceite y tienen una gran cantidad de grupos hidroxilo conectados al esqueleto molecular. Tienen buena solubilidad en agua y tienen. Solubilidad tanto en aceite como en agua. Cuando la acetona coincide, la solubilidad de las proantocianidinas aumenta naturalmente y su tasa de extracción mejora en consecuencia.
2-3 Método de extracción asistida por instrumentos
La extracción supercrítica y la extracción asistida por ultrasonidos se utilizan cada vez más para la extracción de proantocianidinas de semillas de uva.
CO supercrítico: la tasa de extracción es alta y las proantocianidinas no se ven afectadas por el aire ni la luz. Sin embargo, debido al costoso equipo, es difícil promover su uso. El método ultrasónico se usa ampliamente. La fuerte vibración, alta aceleración, fuerte efecto de cavitación, agitación y otros efectos especiales generados por las ondas ultrasónicas pueden destruir las paredes celulares de las plantas, permitiendo que el solvente penetre en las células, permitiendo que los componentes químicos se disuelvan. en el disolvente, mejorando así la eficiencia de extracción. Muestra un rendimiento superior en la extracción de sustancias sensibles al calor como las proantocianidinas.
3 Detección de proantocianidinas de semillas de uva
Dado que la mayoría de los polifenoles en las semillas de uva y los extractos de semillas de uva son proantocianidinas (generalmente representan 70% a 85%), por lo que muchos fabricantes utilizan proantocianidinas para calibrar el contenido de ingredientes activos. El contenido de proantocianidina es un indicador clave que refleja la calidad del extracto de semilla de uva o de las semillas de uva. Hay dos indicadores principales, a saber, el valor de proantocianidina y el contenido de proantocianidina.
3.1 Determinación del valor de proantocianidina
La determinación del valor de proantocianidina adopta el método de Bates-smith y el método de Poaer. Principio: Las procianidinas se calientan en condiciones ácidas y se convierten en antocianinas rojas, mientras que los monómeros de flavan-3-ol como la catequina y la epicatequina no tienen esta reacción (Figura 2). Los resultados que midieron son el contenido relativo de proantocianidinas, expresado por índice de proantocianidinas y PVU respectivamente, que se obtienen con base en fórmulas empíricas. El índice de proantocianidina en el extracto de semilla de uva generalmente está entre 80 y 100, y el PVU generalmente está entre 250 y 350.
El valor de proantocianidinas es sólo un contenido relativo, no el contenido real de proantocianidinas. Según la encuesta, los productos con un valor de proantocianidina de 95 tienen una diferencia del 15% en el contenido de polifenoles y la calidad es bastante diferente. Muchos fabricantes utilizan el índice de proantocianidinas para expresar el porcentaje de proantocianidinas en el extracto de semilla de uva, lo cual es incorrecto.
Figura 2 Reacción de producción de antocianinas Fig. 2 Reacción de producción de cianuración
3.2 Determinación del contenido de proantocianidinas
Existen muchos métodos para determinar el contenido de proantocianidinas, que también son bastante confusos. Los siguientes métodos se utilizan comúnmente.
3.2.1 Método catalítico de sal de hierro
El principio de reacción de este método es el mismo que el de la determinación del valor de proantocianidina. Los estándares de proantocianidina se utilizan para calcular el contenido de proantocianidina. El Fe¨ y el ácido clorhídrico son catalizadores y agentes de acidólisis comúnmente utilizados. Dado que el valor de absorbancia es muy bajo cuando se usa agua o etanol como medio de reacción, generalmente se usa n-butanol como medio de reacción15-161. Operaciones específicas habituales: Tome 1,0 ml de solución de muestra (o solución de proantocianidina) en un tubo de ensayo graduado de 10 ml, agregue 6,0 ml de ácido clorhídrico concentrado en n-butanol (95:5) y una solución de sulfato férrico de amonio al 2% (disuelto en 2 mol/ L ácido clorhídrico) 0,2 ml, mezclar bien, colocar en un baño de agua hirviendo y calentar durante 40 minutos, sacar inmediatamente y enfriar rápidamente a temperatura ambiente con agua helada y medir el valor de absorbancia a 550 Nm.
Este método es más sencillo y tiene mejor respuesta selectiva a las proantocianidinas. El método de catálisis con sal de hierro tiene requisitos estrictos sobre el contenido de agua y la concentración de Fe en el sistema de reacción. Generalmente, el contenido de agua es del 6% y la concentración de Fe es del 4,5x10%. Además, la concentración excesiva de Fe no tiene ningún efecto sobre la reacción. . La investigación de Fu Wusheng l61 muestra que del 3% al 4% es el contenido de agua apropiado, y la concentración de Fe se selecciona en 9. Aproximadamente OxlO%. Sin embargo, algunos estudiosos han llegado a la conclusión de que un contenido de agua del 2 % al 6 % tiene un efecto inhibidor sobre la formación de antocianinas, y una concentración de Fe¨ ligeramente superior (>15 g/L) también inhibe la formación de antocianinas.
Sobre la base de la reacción catalítica de la sal de hierro, Yang Dajin I y otros utilizaron cromatografía líquida de alto rendimiento para detectar el contenido de proantocianidinas. En este método, los iones de antocianina de color rojo intenso generados por las proantocianidinas en las condiciones catalíticas de sal de hierro mencionadas anteriormente se analizan mediante cromatografía líquida de alta resolución para determinar el contenido de proantocianidinas. Este método puede eliminar la influencia de algunas impurezas y tiene la ventaja de obtener resultados cualitativos y cuantitativos precisos.
3.2.2 Método de la vainillina
Principio de medición: el anillo A de proantocianidinas y monómeros de catequina tiene una alta actividad química. En condiciones ácidas, el anillo A que contiene floroquinona o floroglucinol se condensa con vainillina. , y el producto forma un ion de carbono rojo bajo la acción de un ácido concentrado. La concentración de la muestra se correlaciona positivamente con el color producido. Su valor de absorción de luz se mide a una longitud de onda de 500 llm l91 (Figura 3).
Figura 3 Reacción de condensación fenólica
Cuando se mide el método de vainillina, generalmente se usa catequina como estándar y metanol como solvente. Tanto el ácido clorhídrico como el ácido sulfúrico se pueden utilizar como catalizadores en el proceso de reacción, pero cuando se utiliza ácido sulfúrico, la concentración no debe ser demasiado alta. El ácido sulfúrico demasiado alto puede provocar fácilmente que la vainillina experimente una reacción de autocondensación y descomposición oxidativa. Hay muchos métodos de operación específicos: 1 ml de solución de prueba + 2,5 ml de solución de vainillina y metanol al 1 % + 2,5 ml de ácido sulfúrico al 25 % o ácido clorhídrico al 8 % (ambos disueltos en metanol), 30. Reaccionar dos veces durante 15 min~20 min2l. Feo; 1 ml de solución de prueba + 6 ml de solución de vainillina metanólica al 4% + 3 ml de ácido clorhídrico concentrado, reaccionan a temperatura ambiente durante 15 minL231; algunos incluso reaccionan a 20°C durante 15 h[241; Los métodos de operación son bastante diferentes, lo que no favorece la elección del usuario y debe unificarse.
3.2_3 Espectrofotometría ultravioleta
Las proantocianidinas son sustancias incoloras sin un pico de absorción característico en la región de la luz visible y un pico de absorción único en la región ultravioleta, con una longitud de onda máxima de absorción de 280 Nm. . en. Aunque este método es sencillo y rápido, sólo es adecuado para productos con un contenido de proantocianidinas de pureza particularmente alta y no es adecuado para la detección de proantocianidinas en materias primas en general. Esto se debe a que las catequinas también tienen una absorción máxima a 280 Nm, V, Vc, Ve. , Ve, rutina, B-caroteno y otras sustancias tienen una absorción evidente en esta longitud de onda.
3.2.4 Método combinado de Folin-Ciocaheau y HPLC
Este método es un método recomendado por el Comité de Evaluación del Método Americano de Semillas de Uva. El método Folin-Ciocaheau determina el contenido de polifenoles, utilizando generalmente ácido gálico como sustancia de control. En solución alcalina, los polifenoles pueden reducir el ácido tungstomolíbdico para formar un compuesto azul con una absorción máxima a 760 Nm. El contenido de polifenoles en el extracto de semilla de uva suele oscilar entre el 75% y el 95%. Se utilizó HPLC para medir el contenido de cuatro monómeros: ácido gálico, catequina, epicatequina y galato de epicatequina para representar la cantidad total de monómeros. Esto se debe a que el contenido de estos cuatro monómeros representa más del 90,0 % del contenido de monómero en el extracto de semilla de uva. El contenido de proantocianidinas es la diferencia entre el contenido de polifenoles y el contenido de monómeros.
La desventaja de este método es que en la reacción de Folin-Ciocalteau también participan sustancias que se oxidan fácilmente, como proteínas, aminoácidos, ácidos nucleicos y ácido ascórbico. Al mismo tiempo, dado que el contenido de ácido gálico en el extracto de semilla de uva es muy pequeño (0% ~ 1,2%), es diferente de la catequina (1,5% ~ 7,3%) y la epicatequina (2,0% ~ 5,0%). El contenido es muy diferente y el contenido de proantocianidinas expresado en cantidad de ácido gálico no es representativo.
3.2.5 Espectrofotometría de molibdato de amonio
Se basa en la formación de éster de molibdato de color amarillo entre catecol y molibdato de amonio en un medio débilmente ácido. El producto de la reacción tiene máxima absorción a. la longitud de onda de 333 nm. Ma Yajun realizó una exploración simple de las condiciones de detección en pulgadas: tome 0,08 mol, 1 ml de solución de molibdato de amonio L y colóquelo en un tubo colorimétrico de 25 ml, agregue una cantidad adecuada de solución de prueba y use 1. El ácido clorhídrico Ox10 mol/L alcanza la marca y la reacción se completa instantáneamente.
Según el principio de reacción, las antocianinas, el ácido gálico y las catequinas tienen una estructura de catecol y también participan en la generación de ésteres de molibdato. La selectividad de la medición de las proantocianidinas no es alta y se ve muy afectada por las impurezas. .
3.2.6 Otros métodos de determinación
Ma Yajun estudió el método de determinación del contenido de proantocianidinas: espectrofotometría de sal férrica y ferricianuro de potasio, que se basa en la capacidad de las proantocianidinas para reducir el Fe a Fe, y el ferricianuro de potasio y Fe forman un compuesto de coordinación soluble de color azul oscuro con absorción máxima a 710 nm, según el principio de espectrofotometría del sulfato cérico de amonio, que se basa en la reacción de proantocianidinas y Ce en un medio ácido fuerte. Se genera Ce incoloro, y Ce "tiene una absorción máxima a una longitud de onda de 319 nm. Al medir la absorbancia de las sales amarillas con alto contenido de cerio, las proantocianidinas se determinan indirectamente. También existe un método de quimioluminiscencia inhibida por inyección de flujo [271: en condiciones alcalinas, el uso de proantocianidinas para reducir H:O: puede inhibir la quimioluminiscencia del sistema luminol-H20, y el grado de inhibición está relacionado linealmente con la concentración de proantocianidinas. Estos tres métodos son similares al método de Folin-Ciocaheau, que utiliza las propiedades reductoras de los polifenoles para determinar el contenido de polifenoles. Como resultado, se aumenta el contenido de proantocianidinas.
En resumen, la medición del valor de proantocianidinas se basa únicamente en fórmulas empíricas, no en el contenido real de proantocianidinas, y está desactualizada con los métodos de detección modernos. El método catalizado por sal de hierro para la determinación de proantocianidinas es muy específico y tiene buenas perspectivas de aplicación, pero aún se necesitan más investigaciones y mejoras. El método de la vainillina mide la cantidad total de proantocianidinas y monómeros de flavan-3-ol. El contenido de proantocianidinas se puede calcular combinando el método de HPLC para detectar el contenido de monómeros de flavan-3-ol: catequina y epicatequina. Sin embargo, existen muchos métodos operativos para el método de la vainillina, lo que no favorece la elección del usuario, y es necesario unificar los métodos operativos específicos. Algunos académicos extranjeros utilizan la tecnología HPLC/MS para analizar y detectar proantocianidinas. El proceso es complicado y los requisitos técnicos son altos, por lo que no se puede utilizar ampliamente en la determinación de productos de proantocianidinas.
4 Outlook
Las proantocianidinas de semillas de uva tienen funciones antienvejecimiento, antienfermedades cardiovasculares y anticancerígenas muy eficaces. Además, también tienen funciones antirradiación y antifatiga. y efectos de memoria mejorados, lo que demuestra una actividad biológica y una seguridad superiores incomparables. En la actualidad existen más de 50 empresas productoras y comercializadoras de extracto de semilla de uva en mi país, con una capacidad de producción anual de más de 80 toneladas. Por lo tanto, para adaptarse al vigoroso desarrollo de la industria del extracto de semilla de uva, existe una necesidad urgente de establecer un método de medición unificado para el contenido de proantocianidinas en las semillas de uva y sus productos, a fin de facilitar la producción y el comercio de las empresas. , control de calidad del producto y orientación al consumo del cliente.