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¿Cuál es el principio de detección del kit de detección de furazolidona?

Categoría: Medicina y Salud

Análisis:

Kit de prueba de furazolidona

El kit de prueba de furazolidona se utiliza para detectar furazolidona en alimentos animales de residuos de furazolidona. De acuerdo con los estándares de clasificación de productos más detallados de Beijing Wanger Biotechnology Co., Ltd., se puede dividir en dos tipos, uno es un kit de prueba especial para productos acuáticos y el otro es un kit de prueba para productos ganaderos y avícolas comunes. El método de detección es el siguiente:

1. Especial para productos acuáticos:

1. Resumen

Los medicamentos con nitrofurano tienen muy buenos efectos antibacterianos y farmacocinética. Ampliamente utilizado como aditivo promotor del crecimiento de aves de corral, productos acuáticos y cerdos. Sin embargo, durante investigaciones experimentales de larga duración, se descubrió que los fármacos y sus metabolitos del nitrofurano pueden causar cáncer y mutaciones genéticas en animales de experimentación. Por esta razón, está prohibido utilizar dichos fármacos en tratamientos y piensos. La furazolidona fue prohibida en 1995.

Dado que los fármacos nitrofuranos se pueden metabolizar rápidamente en el cuerpo y los metabolitos unidos en los tejidos pueden permanecer durante un largo período de tiempo, a menudo es necesario analizar los residuos de dichos fármacos después de analizar los productos. metabolismo, el departamento de gestión utiliza la detección de metabolitos como medio para detectar residuos de nitrofurano. AOZ, el metabolito de la furazolidona; AMOZ, el metabolito de la furazolidona AHD, el metabolito de la nitrofuranotoína; SEM del metabolito de la nitrofurfurilhidrazona (nitrofuracilina);

Los métodos más comunes utilizados para detectar metabolitos de furazolidona son LC-UV, LC-MS y LC-MS/MS. El método de inmunoensayo ligado a enzimas combina tecnología de cromatografía y utiliza anticuerpos específicos de derivados de AOZ. Tiene alta precisión, respuesta más sensible, requisitos técnicos operativos más bajos y tiempo de detección corto, y tiene las características de un gran volumen de muestra de detección.

Este kit puede determinar la cantidad residual de metabolitos de furazolidona en muestras acuáticas.

2. Principio

Este kit utiliza el método ELISA de competencia indirecta, recubriendo previamente el antígeno acoplado en la tira de micropocillos, y el residuo AOZ en la muestra se derivatiza y se mezcla con el tira de micropocillos. El antígeno conjugado previamente recubierto en la tira de pocillos compite con el anticuerpo derivado contra los metabolitos de furazolidona. Después de agregar el anticuerpo secundario marcado con enzima, el color se desarrolla con otros sustratos de TMB. El valor de absorbancia de la muestra se correlaciona negativamente. el contenido del residuo AOZ que contiene comparándolo con la curva estándar, se puede obtener la cantidad residual de metabolito de furazolidona del residuo correspondiente.

Características del kit

Sensibilidad del kit: 0.025ppb

Límite de detección inferior

Existe cierta interferencia en tejidos acuáticos como camarones y peces , el límite de detección inferior es 0,1 ppb

Tasa de recuperación de muestras

Organización pesquera………………………………………… 80±15%

Tasa de reacción cruzada

Metabolito de furazolidona…………………………………… 100%

Metabolito de furazolidona………… ……… ………………< 0,01%

Metabolito de nitrofurantoína………………………………< 0,01%

Metabolitos de nitrofurfurano hidrazona (furacilina)………… …………< 0,01%

3. Composición del kit

1. Placa de enzimas de 96 pocillos × 1 (recubierta con antígeno acoplado)

2. Estándar solución p>

3. Anticuerpo secundario marcado con enzima 12ml …………………… Tapa roja

4. Anticuerpo concentrado 0,8ml …………………… Tapa verde

5. Solución de sustrato A, 7 ml …………………, tapa blanca

6. Solución de sustrato B, 7 ml ………………………, tapa roja

7. Solución de parada 7ml ………… Tapón amarillo

8. Solución de lavado concentrada 20× 40ml …………………… Tapón transparente

9. 2×solución concentrada 50ml…………………… Tapa transparente

4. Instrumentos y reactivos utilizados

Instrumentos:

┅┅Microplaca lector 450nm/630nm

┅┅Homogeneizador

┅┅Agitador

┅┅Centrífuga

┅┅Micropipeta: monocanal 20ml～ 200ml, 200ml～1000ml

Canal múltiple 250ml

┅┅Equilibrio: sensibilidad 0,01g

Reactivos:

┅┅acetato de etilo

┅┅n-hexano (o n-heptano)

┅┅K2HPO4?3H2O

┅┅2-Nitrobenzaldehído

┅┅ Metanol

┅┅HCl concentrado

┅┅NaOH

5. Pasos de preprocesamiento de la muestra

Nota: Instrucciones antes del procesamiento de la muestra

Al manipular cualquier muestra, debe prestar atención a:

(a) Se debe utilizar succión desechable en el experimento. La punta debe reemplazarse al absorber diferentes reactivos.

(b) Antes del experimento, verifique si varios equipos experimentales están limpios. Si es necesario,

limpie el equipo experimental para evitar contaminación que interfiera con los resultados experimentales.

El pretratamiento de la muestra requiere preparación:

Solución 1: reactivo de derivatización 15,1 mg de 2-nitrobenzaldehído

Añadir 10 ml de metanol para disolver (la concentración es 10 mM).

Preparación de solución 2: Diluya la solución compleja concentrada 2X 1:1 con agua desionizada (1 parte de solución compleja concentrada + 1 parte de agua desionizada) para la dilución de anticuerpos y la reconstitución de la muestra.

Solución 3: K2HPO4 0,1M 22,8g K2HPO4?3H2O

Añadir agua desionizada para disolver y ajustar a 1L.

Solución 4: HCl 1M 8,3ml HCl concentrado

Diluir a 100ml con agua desionizada.

Solución 5: NaOH 1M 4g NaOH

Disolver en agua desionizada y ajustar a 100ml.

(a) Pretratamiento de muestras de productos acuáticos

┅┅Utilice un homogeneizador para homogeneizar la muestra

┅┅Tome 1±0,05 g de material homogeneizado (; pescado/camarones), añadir 4 ml de agua destilada, 0,5 ml de HCL 1 M y 100 ml de reactivo de derivatización respectivamente, agitar bien

┅┅Incubar a 37 oC durante la noche (aproximadamente 16 h); p> ┅┅Agregar 5 ml de K2HPO4 0,1 M, 0,4 ml de NaOH 1 M y 5 ml de acetato de etilo respectivamente, agitar vigorosamente durante 30 segundos

┅┅Centrifugar a temperatura ambiente (20-25 oC/68-77 ℉) arriba; 3000g durante 10min ;

┅┅Poner 2,5ml de acetato de etilo en otro recipiente y secar con nitrógeno a 50oC o evaporar a sequedad con un rotavapor;

┅┅Usar 1ml de n-hexano (o n-heptano) alcano), disolver el material seco y mezclar bien con 1 ml de la solución compleja diluida

┅┅Centrifugar a temperatura ambiente (20-25oC/68-77); ℉) por encima de 3000 g durante 10 minutos

┅┅Tomar 50 ml del líquido inferior para análisis.

Factor de dilución de la muestra: 2

Nota: Las muestras deben almacenarse en un lugar fresco y oscuro y deben refrigerarse.

6. Procedimiento de inmunoensayo enzimático:

Cosas a tener en cuenta antes de la medición:

1. Antes de usar, aumente la temperatura de todos los reactivos y las tiras requeridas a temperatura ambiente. (20-25℃).

2. Devuelva inmediatamente todos los reactivos a 2-8°C después de su uso.

3. La reproducibilidad en el análisis ELISA depende en gran medida de la consistencia del lavado de la placa. La operación correcta de lavado de la placa es el punto clave en el procedimiento de determinación ELISA.

4. Durante todos los procesos de incubación a temperatura constante, evite la exposición a la luz y cubra la microplaca con una película protectora.

Pasos de operación:

1. Saque el kit del ambiente refrigerado, extraiga los reactivos necesarios del kit y déjelo que se equilibre a temperatura ambiente (20-25 ℃). durante más de 30 minutos. Nota Cada reactivo líquido debe agitarse bien antes de su uso.

2. Preparación líquida: diluya 40 ml de líquido de lavado concentrado (20 veces concentrado) con agua desionizada hasta 800 ml para su uso posterior (o diluya según sea necesario) y almacene el líquido de lavado diluido a 4 °C

Puede almacenarse en el ambiente durante un mes y debe calentarse antes de su uso.

3. Retire la rejilla para placas y el número necesario de microplacas, vuelva a sellar las microplacas no utilizadas y guárdelas a 2-8°C sin congelar.

4. Numeración: Numere los micropocillos correspondientes de las muestras y estándares en secuencia. Cada muestra y estándar requiere 2 pocillos.

5. Diluir el anticuerpo concentrado 11 veces con la solución del complejo diluido (añadir 1 parte de anticuerpo por 10 partes de diluyente).

6. Agregue 50 ml/pocillo de estándar/muestra, luego agregue 50 ml/pocillo de anticuerpo diluido, cubra la placa con una película protectora, reaccione a 25 ℃ durante 60 minutos, retire y agregue solución de lavado a cada uno. bien 250 ml, lave la placa 5 veces, 10 segundos cada vez, y seque (las burbujas de aire que no se hayan eliminado después de secar se pueden perforar con una punta de pipeta limpia).

7. Añadir anticuerpo secundario marcado con enzima: Añadir 100ml a cada pocillo, cubrir la placa con una película protectora y colocarla en un ambiente a 25°C para que reaccione durante 30 minutos. Saque y agregue 250 ml de solución de lavado a cada pocillo, lave la placa 5 veces, 10 segundos cada vez y seque (las burbujas de aire que no se hayan eliminado después de secar se pueden perforar con una punta de pipeta limpia).

8. Desarrollo del color: Añadir 50ml de solución de cromógeno A a cada pocillo, luego añadir 50ml de solución B, agitar suavemente para mezclar y desarrollar el color durante 30 minutos en un ambiente oscuro a 25°C.

9. Determinación: Añadir 50 ml de solución de parada a cada pocillo, agitar suavemente para mezclar y configurar el lector de microplacas a 450 nm (se recomienda utilizar detección de longitud de onda dual de 450/630 nm y leer los datos). en 5 minutos). Determine el valor de DO de cada pocillo.

7. Juicio de resultados

Hay dos métodos para juzgar resultados. El primer método se puede utilizar para un juicio aproximado y el segundo método se puede utilizar para un juicio cuantitativo. Tenga en cuenta que el valor de absorbancia de la muestra está inversamente relacionado con el contenido de AOZ.

1. Compare el valor de absorbancia promedio de la muestra con el valor estándar para obtener el rango de concentración (?g/L).

Suponga que el valor de absorbancia de la muestra 1 es 0,310 y el de la muestra 2 es 0,820. Los valores de absorbancia de la solución estándar son: 0,225 ppb es 0,760; es 0,389; 2,025 ppb es 0,118. Entonces el rango de concentración de la muestra 1 es 0,675 ppb-2,025 ppb, multiplicado por su correspondiente factor de dilución; el rango de concentración de la muestra 2 es 0,075 ppb-0,225 ppb, multiplicado por su correspondiente factor de dilución;

2. Análisis cuantitativo

(1) Cálculo del porcentaje de absorbancia El porcentaje de absorbancia del estándar o muestra es igual al promedio de los valores de porcentaje de absorbancia del estándar o. muestra (doble pocillo) dividida por el valor de absorbancia del primer estándar (estándar 0) y luego multiplicada por 100%, es decir,

Valor de absorbancia porcentual (%) = B × 100%

B: el valor de absorbancia promedio de la solución estándar o solución de muestra

B0: el valor de absorbancia promedio de la solución estándar de 0?g/L

(2) Dibujo y cálculo de la curva estándar

Dibuje la curva estándar utilizando el porcentaje de absorbancia del estándar como ordenada y el semilogaritmo de la concentración estándar del metabolito de furazolidona (?g /L) como la abscisa. Sustituya el porcentaje de absorbancia de la muestra en la curva estándar, lea la concentración correspondiente a la muestra en la curva estándar y multiplíquela por el factor de dilución correspondiente para obtener la concentración real de AOZ en la muestra. (Los métodos de cálculo específicos requieren un software especial)

2. Tipo ordinario

El esquema y el principio son los mismos que los anteriores.

Características del kit

Sensibilidad del kit: 0,05ppb

Límite inferior de detección

Límite inferior de detección para tejido y miel: 0,1ppb

Debido a cierta interferencia en camarones, peces y otros tejidos acuáticos, el límite de detección es de 0,2 ppb

El límite de detección de huevos es de 0,1 ppb

Tasa de recuperación de muestra

Productos acuáticos, músculo, tejido hepático…………………… 75±15%

Muestra de miel………………………………………… 90 ±15%

Muestra de huevo…………………………………………90±20%

Tasa de reacción cruzada

Metabolitos de furazolidona………………………………………… 100%

Metabolitos de furazolidona………………………………< 0,01%

Metabolitos de nitrofurantoína…………………………< 0,01%

Metabolitos de nitrofurfurilhidrazona (nitrofuracilina)………… ……< 0,01%

3. Composición del kit

1. Placa de enzimas de 96 pocillos × 1 (recubierta con antígeno conjugado)

2 , solución estándar …………………… Tapa roja

4 .Concentrado de anticuerpos 0.8ml …………………… Tapa verde

5. Solución de sustrato A 7ml ……………………… Tapa blanca

6. Solución de sustrato B 7ml ……………………… Tapa roja

7. Solución de parada 7ml… …………………… Tapa amarilla

8. Solución de lavado concentrada 20× 40ml………………Tapa transparente

9. 2×solución concentrada 50ml ……………… Tapa transparente

Instrumentos y reactivos utilizados

Instrumento:

┅┅Lector de microplacas 450nm /630nm

┅┅Homogeneizador

┅┅Agitador

┅┅Centrífuga

┅┅Micropipeta: Canal único 20ml～200ml, 200ml～1000ml

Canal múltiple 250ml

┅┅ Balanza: sensibilidad 0,01g

Reactivos:

┅┅Acetato de etilo

┅┅n-hexano

┅┅K2HPO4?3H2O

┅┅2-nitrobenzaldehído

┅┅Metanol

┅┅Nitrosoferricianuro de potasio (K2Fe(CN)5?NO?3H2O) (para muestras de leche)

┅┅ZnSO4?7 H2O ( (para muestras de leche)

┅┅HCl concentrado

┅┅NaOH

5. Pasos de pretratamiento de muestras

Nota: Precauciones en el procesamiento de muestras

A la hora de manipular cualquier muestra, se debe prestar atención a:

(a) Se deben utilizar pipetas desechables durante el experimento, al absorber diferentes reactivos

Para reemplazar el cabezal de succión.

(b) Antes del experimento, verifique si varios equipos experimentales están limpios. Si es necesario, limpie el equipo experimental para evitar contaminación que interfiera con los resultados experimentales.

El pretratamiento de la muestra requiere preparación:

Solución 1: reactivo de derivatización 15,1 mg de 2-nitrobenzaldehído

Añadir 10 ml de metanol para disolver (la concentración es 10 mM).

Solución 2: utilice agua desionizada para diluir 2 veces la solución compleja concentrada y agua desionizada en una proporción de volumen de 1:1 (1 parte de solución compleja concentrada + 1 parte de agua desionizada) para la dilución de anticuerpos y la reconstitución de muestras.

Solución 3: Solución C (para muestras de leche): 12,5g de nitrosoferricianuro potásico

Disolver en agua desionizada y ajustar a 100ml

Líquido D (para muestras de leche ): 29,8g de sulfato de zinc

Disolver en agua desionizada y ajustar a 100ml.

Solución 4: K2HPO4 0,1M 22,8g K2HPO4?3H2O

Añadir agua desionizada para disolver y ajustar a 1L.

Solución 5: HCl 1M 8,3ml HCl concentrado

Diluir a 100ml con agua desionizada.

Solución 6: NaOH 1M 4g NaOH

Disolver en agua desionizada y ajustar a 100ml.

(a) Muestras de pescado, camarón y carne

┅┅Homogeneizar las muestras con un homogeneizador

┅┅Continuar con el método de descripción de d.

Nota: Las muestras deben conservarse en un lugar fresco, oscuro y refrigerado

(b) Muestra de leche

┅┅Sacar 5ml de la muestra en un tubo de centrífuga de vidrio Medio;

┅┅Agregue 250 ml de líquido C y 250 ml de líquido D respectivamente

┅┅Use un oscilador para mezclar bien la muestra, luego centrifugue con una constante; Centrífuga a temperatura de 3000 go más durante 10 minutos, 4-12 oC (39-54 ℉). Si no se dispone de una centrífuga a temperatura constante, primero enfríe la muestra a aproximadamente 8 oC (46 ℉) y luego centrifugue;

┅┅Descripción del método de d

┅┅Poner 1g de muestra en un tubo de centrífuga

┅┅Añadir 4 ml de agua destilada y agitar para disolver, 0,5 ml de HCL 1M y 100 ml; de reactivo de derivatización, agite bien

┅┅Vaya al paso d para describir el método (marcado con *).

(d) Continuar con el método anterior

┅┅Tomar 1,1 ml de sobrenadante centrífugo de 1 ± 0,05 g de homogeneizado (muestra de pescado y camarón/carne) y leche (equivalente a (en 1 ml de muestra de leche), añadir 4 ml de agua destilada, 0,5 ml de HCL 1 M y 100 ml de reactivo de derivatización respectivamente, agitar bien;

*┅┅Incubar a 37 oC durante la noche (aproximadamente 16 h );

┅┅Agregue 5 ml de K2HPO4 0,1 M, 0,4 ml de NaOH 1 M y 5 ml de acetato de etilo respectivamente, agite vigorosamente durante 30 s

┅┅3000 g a temperatura ambiente (20-25 oC; /68-77℉) Centrifugar lo anterior durante 10 minutos

┅┅Poner 2,5 ml de acetato de etilo en otro recipiente y secar con nitrógeno a 50oC o evaporar hasta sequedad con un rotavapor

┅┅Disolver con 1ml de n-hexano Para la materia seca, mezclar bien con 1 ml de solución compleja diluida;

┅┅Centrifugar a 3000g o más durante 10 minutos a temperatura ambiente (20- 25oC/68-77℉);

┅┅ Se usaron 50 ml de líquido inferior para el análisis.

Factor de dilución de la muestra: 2

Nota: Las muestras deben almacenarse en un lugar fresco y oscuro y deben refrigerarse.

(e) Huevos

┅┅Pesar 2g de la muestra de huevo preparada y añadirla a un tubo de centrífuga de 50ml. Añadir 4ml de agua, 0,5ml de HCl 1M y 200ºC. solución respectivamente, agite y mezcle

┅┅Agregue una solución de 200 lD, agite bien durante 5 minutos y centrifugue a 3000 go más durante 10 minutos a temperatura ambiente (20-25 °C); /p>

┅┅Tomar todo el sobrenadante, añadir 200?l de reactivo de derivatización, agitar bien y mantener en baño María a 50°C durante 2 horas (agitar vigorosamente durante 1-2 minutos cada media hora);

┅┅Agregue 5 ml de K2HPO4 0,1 M y 0,4 ml de NaOH 1 M respectivamente, 5 ml de acetato de etilo, agite vigorosamente durante 30 segundos, centrifugue a 3000 go más durante 10 minutos a temperatura ambiente (20 ~ 25 ℃);

┅┅Tomar 2,5 ml de la fase orgánica superior y secar con nitrógeno a 50 ℃;

┅┅Disolver el material seco en 1 ml de n-hexano, añadir 2 ml de la solución reconstituida diluida, agite durante 10 segundos y centrifugue a 3000 go más durante 10 minutos (si se produce emulsificación, caliente en un baño de agua a 60 °C durante 5 minutos y luego repita la centrifugación);

┅┅Retire la fase orgánica superior y retirar 50 µl de la fase acuosa inferior para su análisis.

Factor de dilución de la muestra: 2

6. Procedimiento de inmunoensayo enzimático:

Cosas a tener en cuenta antes de la medición:

1. Antes de usar Caliente todos los reactivos y las tiras necesarias a temperatura ambiente. (20-25℃).

2. Devuelva inmediatamente todos los reactivos a 2-8°C después de su uso.

4. Durante todos los procesos de incubación a temperatura constante, evite la exposición a la luz y cubra la microplaca con una película protectora.

Pasos de operación:

1. Saque el kit del ambiente refrigerado, saque los reactivos necesarios del kit y equilibrelo a temperatura ambiente (20-25 ℃) durante más de 30 minutos Nota Cada reactivo líquido debe agitarse bien antes de su uso.

2. Preparación líquida: diluya 40 ml de líquido de lavado concentrado (20 veces concentrado) con agua desionizada a 800 ml para su uso posterior (o diluya según sea necesario. El líquido de lavado diluido se puede almacenar a 4 °C). , también es necesario calentarlo antes de su uso.

3. Retire la rejilla para placas y el número necesario de microplacas, vuelva a sellar las microplacas no utilizadas y guárdelas a 2-8°C sin congelar.

4. Numeración: Numere los micropocillos correspondientes de las muestras y estándares en secuencia. Cada muestra y estándar requiere 2 pocillos.

5. Diluir el anticuerpo concentrado 11 veces con la solución del complejo diluido (añadir 1 parte de anticuerpo por 10 partes de diluyente).

7. Añadir anticuerpo secundario marcado con enzima: añadir 100ml a cada pocillo, cubrir la placa con una película protectora y colocarla en un ambiente a 25°C para que reaccione durante 30 minutos. Saque y agregue 250 ml de solución de lavado a cada pocillo, lave la placa 5 veces, 10 segundos cada vez y seque (las burbujas de aire que no se hayan eliminado después de secar se pueden perforar con una punta de pipeta limpia).

7. Juicio de resultados

1. Compare el valor de absorbancia promedio de la muestra con el valor estándar para obtener el rango de concentración (ppb).

Suponga que el valor de absorbancia de la muestra 1 es 0,310 y el de la muestra 2 es 0,820. Los valores de absorbancia de la solución estándar son: 0,45 ppb es 1,320; es 0,389; 4,05 ppb es 0,198. Entonces el rango de concentración de la muestra 1 es 1.35ppb-4.05ppb, multiplicado por su correspondiente factor de dilución; el rango de concentración de la muestra 2 es 0.15 ppb-0.45 ppb, multiplicado por su correspondiente factor de dilución.

2. Análisis cuantitativo

Valor de absorbancia porcentual (%) = B × 100%

B: el valor de absorbancia promedio de la solución estándar o solución de muestra

B0: el valor de absorbancia promedio de la solución estándar de 0?g/L

(2) Dibujo y cálculo de la curva estándar

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