Varias técnicas de hibridación comunes para la hibridación molecular
(1) Hibridación Southern: la electroforesis separa fragmentos de ADN y los transfiere del gel a un filtro de nitrocelulosa o membrana de nailon. Luego se hibrida con la sonda. El objeto de detección es el ADN y la sonda es el ADN o el ARN.
(2) Hibridación Northern: Después de la electroforesis, transferir el fragmento de ARN del gel a un filtro de nitrocelulosa y luego hibridar con la sonda. El objeto de detección es el ARN y la sonda es el ADN o el ARN.
Dependiendo del método utilizado para la hibridación, también existen la hibridación de puntos, la hibridación de ranuras y la hibridación in situ de colonias. Se encuentran disponibles tres soportes sólidos para la hibridación: filtros de nitrocelulosa, membranas de nailon y papel de filtro Whatman 541. Las diferentes marcas de membranas de nailon deben tratarse de manera diferente y la fijación e hibridación del ADN deben realizarse estrictamente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El papel de filtro Whatman 541 tiene una alta resistencia a la humedad y se utilizó por primera vez para detectar colonias bacterianas. El papel de filtro se utiliza principalmente para examinar algunas bibliotecas de genes. Las condiciones de hibridación para el ADN inmovilizado son esencialmente las mismas que las establecidas cuando se utilizan filtros de nitrocelulosa. El papel de filtro Whatman 541 tiene algunas ventajas sobre los filtros de nitrocelulosa: es más económico, más duradero para la hibridación y es menos probable que se deforme y rompa durante el secado. Sin embargo, si el proceso de desnaturalización no es cuidadoso, la intensidad de la señal de hibridación será significativamente más débil que la obtenida utilizando filtros de nitrocelulosa. Por lo tanto, los filtros de nitrocelulosa todavía se utilizan como soportes sólidos para la detección bacteriana de rutina y diversas hibridaciones. La hibridación Southern se puede utilizar para detectar si existen secuencias homólogas a la sonda en los fragmentos de ADN cortados por endonucleasas de restricción, incluidos los siguientes pasos:
(1) Digerir el ADN y separar los fragmentos digeridos mediante electroforesis en gel. y luego desnaturalizar el ADN in situ.
(2) Transferir el fragmento de ADN a un soporte sólido (filtro de nitrocelulosa o membrana de nailon).
(3) Prehibride el filtro para cubrir sitios no específicos en el filtro.
(4) Hibride la sonda con el fragmento de ADN homólogo y luego enjuague para eliminar las sondas unidas no específicamente.
(5) Comprobar la posición del ADN objetivo mediante imágenes.
Que una señal de hibridación pueda detectarse mediante hibridación Southern depende de muchos factores, incluida la proporción entre el ADN objetivo y el ADN total, el tamaño y la actividad específica de la sonda, la cantidad de ADN transferido al filtro, y la relación entre la sonda y la sonda. Emparejamiento entre ADN diana. En condiciones óptimas, la hibridación Southern puede detectar con sensibilidad la actividad específica de sondas altamente activas con actividad inferior a 0,1 pg y ADN complementario marcado con 32P (>:109 cpm/μg) después de varios días de exposición autorradiográfica. Si se transfieren 10 μg de ADN genómico a un filtro, se hibridan con una sonda de varios cientos de nucleótidos de longitud y se exponen durante la noche, se puede detectar una secuencia de copia única de 1 kb de tamaño en el genoma de los mamíferos.
Existen tres métodos principales para transferir ADN de gel a soporte sólido: (1) Transferencia capilar. Este método fue inventado por los sureños, por lo que también se le llama transferencia (o impresión) del sur. La ventaja del método de transferencia capilar es que es sencillo y no requiere otros instrumentos. La desventaja es que el tiempo de transferencia es largo y la señal de hibridación después de la transferencia es débil. (2) Transferencia electroforética. Una vez desnaturalizado el ADN, se puede transferir a una membrana de nailon cargada mediante electroforesis. La ventaja de este método es que no requiere depurinación/hidrólisis y puede transferir directamente fragmentos de ADN más grandes. La desventaja es que la corriente durante la transferencia es grande y la temperatura es difícil de controlar. La transferencia electroforética se utiliza generalmente sólo cuando la transferencia capilar y la transferencia al vacío son ineficaces. (3) Transferencia al vacío. Existen muchos instrumentos comerciales de transferencia por vacío. Generalmente, colocan la membrana de nitrocelulosa o la membrana de nailon en la malla porosa sobre la cámara de vacío, luego colocan el gel en la membrana del filtro y el tampón fluye hacia abajo desde el depósito superior para eluir el ADN en el gel y depositarlo en el filtro. membrana en la membrana del filtro. La ventaja de este método es que es rápido y puede partir de un espesor normal (4-5 mm) y una concentración de agarosa normal (
1, materiales: ADN a analizar, sonda marcada.
2. Equipo: aparato de electroforesis, tanque de electroforesis, cubeta de plástico, horno de vacío, caja de autorradiografía, película de rayos X, bolsa de hibridación, membrana de nitrocelulosa o membrana de nailon, papel de filtro
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(1)10 mg/ml de bromuro de etidio (EB).
(2) Solución Denhardt 50×: 5 g de Ficoll-40, 5 g de PVP, 5 g de BSA, añadir agua hasta 500 ml, filtrar, esterilizar y almacenar a -20 °C.
(3) 1×Blotto: 5g de leche desnatada en polvo, azida sódica al 0,02%, conservada a 4°C.
(4) Solución de prehibridación: 6× SSC, 5× Denhardt, 0,5% SDS, 100 mg/ml de ADN de esperma de salmón, 50% formamida.
(5) Solución de hibridación: Añadir la sonda desnaturalizada a la solución de prehibridación para formar la solución de hibridación.
(6)0,2 mol/L de ácido clorhídrico.
(7)0,1 % lauril sulfato de sodio.
(8)0,4 mol/L de hidrógeno Óxido de sodio .
(9) Solución desnaturalizante: Añadir 87,75 gramos de cloruro de sodio y 20,0 gramos de hidróxido de sodio al agua hasta 1000 ml.
(10) Solución de neutralización: 175,5 g de NaCl, 6,7 g de Tris Cl Cl, añadir agua hasta 1000 ml.
(11) Membrana filtrante de nitrocelulosa.
(12) 20× SSC: 3 mol/L NaCl, 0,3 mol/L citrato de sodio, ajustar el pH a 7,0 con 1 mol/L HCl
(13) 2× , SSC 1×, 0,5×, 0,25× y 0,1×: diluir con SSC 20×.
4. Pasos de la operación:
(1) Digerir 10 pg-10 μg de ADN en un volumen de aproximadamente 50 μl y luego realizar electroforesis en gel de agarosa durante 12 a 24 horas (incluido el peso molecular del ADN). estándar).
(2) Agregue 25 μl de bromuro de etidio de 10 mg/ml a 500 ml de agua, coloque el gel para teñir durante 30 minutos y luego tome fotografías.
(3) Trate el gel con las siguientes soluciones en secuencia, agite suavemente: 500 ml 500 ml 0,2 mol/L HCl 100 minutos, vierta la solución (si el fragmento de restricción es >: 10 kb, ácido tiempo de tratamiento 20 minutos), lavar con agua varias veces, verter la solución 500 ml de solución desnaturalizante dos veces, 15 minutos cada vez, verter 500 ml de solución neutralizante durante 30 minutos; Si se utiliza una membrana de nailon para la hibridación, se puede omitir este paso.
(4) Use guantes, agregue solución de 20×SSC al plato, primero remoje completamente la membrana del filtro de nitrocelulosa con agua esterilizada y luego empápela con 20×SSC. Cubra el filtro de nitrocelulosa del gel con precisión de una vez para eliminar las burbujas de aire. Cubra la membrana del filtro con 3 trozos de papel de filtro empapados en solución 20 × SSC, luego agregue 3 trozos de papel de filtro seco y toallas de papel secas y transfiera durante 2 a 12 horas dependiendo de la complejidad del ADN. Cuando se utiliza una membrana de nailon para la hibridación, la membrana se puede remojar una vez en agua y se pueden usar 0,4 mol/l de NaOH en lugar de 20 × SSC durante la transferencia. La transferencia de transferencia simple tarda de 2 a 3 horas; en el caso de las transferencias genómicas, la transferencia suele tardar más.
(5) Retire la toalla de papel, use un bolígrafo azul para escribir la fecha de transferencia en la esquina superior derecha de la membrana del filtro, márquela, saque la membrana del filtro, lávela 2 veces. SSC durante 5 minutos y secar a 80 ℃ Hornear durante 2 horas. Tenga en cuenta que cuando se utiliza una membrana de nailon para la hibridación, solo se puede secar al aire y no se puede hornear.
(6) Coloque la membrana del filtro en una pequeña bolsa de plástico sellada que contenga entre 6 y 10 ml de solución de prehibridación, agregue la solución de prehibridación al fondo de la bolsa y apriete la bolsa hacia adelante y hacia atrás. para humedecer la membrana del filtro. Prehibridar a una temperatura determinada (normalmente 37-42°C) durante 3-65.438±02 horas y desechar la solución de prehibridación.
(7) Prepare la sonda marcada con isótopos (consulte la Sección 1) y hierva la sonda durante 5 minutos.
(8) Agregue la sonda a la solución de hibridación y mezcle uniformemente. Como se describe en el paso (6), inyecte la solución mezclada en una bolsa de plástico sellada e hibride a la misma temperatura que la prehibridación durante 6-65,438 ± 02 horas.
(9) Retire la membrana del filtro, trátela con las siguientes soluciones en secuencia y agite suavemente: 1× SSC/0,1 % SDS, 15 minutos, dos veces a temperatura ambiente. 0,25X SSC/0,1% SDS, 15 min, dos veces a temperatura de hibridación.
(10) Seque el filtro de nitrocelulosa al aire y luego expóngalo a una película de rayos X. Las bandas de ADN suelen ser visibles después de 1 a 2 días de exposición.
Para sondas con ≥108 cpm/μg traducidas del espacio, se detectaron fácilmente 10 pg de genes de copia única a partir de 10 μg de ADN de mamífero. Los híbridos del norte y del sur son muy similares. La principal diferencia es que el objeto de detección es el ARN y la electroforesis se realiza en condiciones desnaturalizantes para eliminar la estructura secundaria del ARN y garantizar que el ARN esté completamente separado según su tamaño molecular. Hay tres tipos de electroforesis desnaturalizante: electroforesis desnaturalizante de glioxal, electroforesis desnaturalizante de formaldehído y electroforesis desnaturalizante de hidroximetilmercurio. Después de la electroforesis, el ARN se transfiere a través de un gel de agarosa a una membrana de nitrocelulosa de la misma manera que la transferencia Southern y luego se hibrida con la sonda.
1. Materiales: ARN a ensayar y sonda preparada.
2. Equipo: aparato de electroforesis, tanque de electroforesis, cubeta de plástico, horno de vacío, caja de autorradiografía, película de rayos X, bolsa de hibridación, membrana de nitrocelulosa o membrana de nailon.
3. Reactivos:
(1) 20×SSPE: 175,3 g de NaCl, 88,2 g de citrato de sodio, disueltos en 800 ml de agua, ajustar el valor de pH a 7,4 con 10 mol/L de NaOH. , Finalmente disolver a 1L.
(2) Otros reactivos: similares a los reactivos de hibridación Southern, excepto que todos los reactivos se tratan con DEPC.
4. Pasos de la operación:
(1) Después de desnaturalizar y electroforetizar el ARN, el ARN de glioxilo se puede transferir inmediatamente al filtro de nitrocelulosa. El método de transferencia es similar al método de transferencia de ADN.
(2) Después de la transferencia, remoje la membrana en una solución 6XSSC durante 5 minutos a temperatura ambiente para eliminar los fragmentos de agarosa.
(3) Intercale la membrana híbrida entre dos trozos de papel de filtro y séquela en una estufa de vacío a 80 °C durante 0,5 a 2 horas.
(4) Prehibridar con una de las siguientes dos soluciones durante 1-2 horas. Si se realiza a 42 °C, se debe utilizar formamida al 50 %, 5 × SSPE, 2 × reactivo de Denhardt, SDS al 0,1 %; si se realiza a 68 °C, se debe utilizar 6 × SSC, 2 × reactivo de Denhardt y 0,1; % SDS (Nota: BLOTTO no se puede utilizar para la hibridación Northern).
(5) Añadir sonda desnaturalizada marcada radiactivamente a la solución de prehibridación. Si se desea detectar ARNm de baja abundancia, la cantidad de sonda utilizada debe ser de al menos 0,1 μg, su actividad específica debe ser superior a 2×108 cpm/min μg y debe colocarse en condiciones de temperatura apropiadas para la hibridación durante 16 -24 horas.
(6) Lavar la membrana con 1×SSC y 0,1% SDS a temperatura ambiente durante 20 minutos, y luego lavar la membrana tres veces con 0,2×SSC y 0,1% SDS a 68°C durante 20 minutos siempre.
(7) Utilice una película de rayos X (Kodak XAR-2 o equivalente) para la autorradiografía y exponga a -70 °C durante 24 a 48 horas con una pantalla intensificadora adjunta.
[Nota]
(1) Si la concentración de agarosa es superior al 1%, o el espesor del gel es superior a 0,5 cm, o el ARN a analizar es superior a 2,5 kb, necesita usar 0,05. Remoje el gel en mol/L de NaOH durante 20 minutos para hidrolizar parcialmente el ARN y mejorar la eficiencia de transferencia. Después de remojar, lave el gel con agua tratada con DEPC y sumérjalo en 20×SSC durante 45 minutos. Luego transfiéralo a la membrana del filtro.
(2) En el paso (3), si la membrana del filtro contiene ARN de glioxilo, enjuague la membrana del filtro con 20 mmol/L de tris Cl (pH 8,0) a 65 °C antes de la hibridación para eliminar las moléculas de glioxal. del ARN.
(3) El método de transferir ARN del gel a la membrana de nailon es similar al método de transferir ARN al filtro de nitrocelulosa.
(4) Antes de la transferencia de ARN, los geles que contienen formaldehído deben lavarse varias veces con agua tratada con DEPC para eliminar el formaldehído. Cuando utilice membranas de nailon para la hibridación, tenga en cuenta que algunas membranas de nailon cargadas positivamente tienen la capacidad de fijar ácidos nucleicos en soluciones alcalinas. Utilice una solución de NaOH de 7,5 mmol/L para eluir el ARN de glioxilo en agarosa e hidrolizar parcialmente el ARN. eficiencia de la longitud de la molécula de ARN (>: 2,3 kb). Además, el álcali puede eliminar los aductos de glioxal de las moléculas de ARNm, eliminando la necesidad de pasos de elución después de la fijación.
La transferencia de ARN de glioxilo a una membrana de nailon cargada positivamente en condiciones alcalinas también se realizó mediante transferencia de ADN, pero el tampón de transferencia fue NaOH de 7,5 mmol/l. Después de la transferencia (4,5 a 6,0 horas), la membrana de nailon debe enjuagarse con 2×SSC y 0,1 % de SDS durante un período de tiempo y secarse a temperatura ambiente.
(5) La desventaja de la membrana de nailon es su alto fondo, especialmente cuando se utilizan sondas de ARN. Colocar el filtro en una solución alcalina de alta concentración durante un tiempo prolongado provocará un aumento significativo en el fondo de hibridación, que puede solucionarse aumentando la cantidad de agente bloqueador en los pasos de prehibridación e hibridación.
(6) Si se utiliza un tampón neutro para la transferencia de ARN, después de la transferencia, intercale la membrana de nailon seca entre dos trozos de papel de filtro y séquela a 80 °C durante 0,5 a 2 horas, o utilice un filtro con una longitud de onda de luz ultravioleta de 254 nm irradia el lado que contiene ARN de la membrana de nailon. El último método es más complejo, pero se prefiere porque la señal de hibridación de ciertos lotes de membranas de nailon cargadas positivamente puede mejorarse después de este tratamiento. Pero para obtener mejores resultados, debe asegurarse de que la membrana de nailon no esté sobreexpuesta. La irradiación moderada puede hacer que una pequeña cantidad de bases del ARN formen una estructura entrecruzada con los grupos amino cargados positivamente en la superficie de la membrana de nailon, mientras que la irradiación excesiva puede hacer que parte de la timina del ARN se una a la superficie. de la membrana de nailon, lo que resulta en un debilitamiento de la señal de hibridación. Este método se puede utilizar para clonar y cribar un pequeño número de colonias (100-200) dispersas en varias placas de agar. Combine estas colonias en la placa de agar primaria y coloque un filtro de nitrocelulosa en la superficie de la segunda placa de agar. Después de cultivar durante un período de tiempo, las colonias se lisaron in situ. La placa base debe almacenarse a 4 °C hasta que se obtengan los resultados del análisis.
1. Materiales: placas bacterianas a ensayar, sondas etiquetadas, filtros de nitrocelulosa, etc.
2. Equipo: horno a temperatura constante, baño maría a temperatura constante, centrífuga de sobremesa de alta velocidad, etc.
3. Reactivos:
(1) libra de medio de cultivo sólido.
(2)0,5 mol/L hidróxido sódico.
(3)1 mol/L Tris Cl.
(4)1,5 mol/L cloro Sodio cloruro.
(5)0,5 mol/L Tris Cl.
(6) Solución de prelavado: 5× SSC, 0,5 % SDS, 1 mmol/L EDTA (pH 8,0 ).
(7) Solución de prehibridación: 50% formamida, 6×SSC (o 6×SSPE), 0,05×BLOTTO (no se requiere formamida).
(8) Otros reactivos: con hibridación Southern.
4. Pasos de la operación:
1. Transfiera algunas colonias al filtro de nitrocelulosa:
(1) Coloque el filtro de nitrocelulosa en placas de agar que contengan antibióticos selectivos.
(2) Utilice un palillo de dientes estéril para transferir cada colonia a la membrana del filtro y luego transfiérala a una placa principal de agar que contenga antibióticos selectivos pero sin membrana del filtro. La inoculación lineal (o inoculación puntual) debe realizarse según una cuadrícula determinada. Cada colonia debe marcarse en el mismo lugar en ambas placas. Finalmente, dibuje colonias que contengan plásmidos no recombinantes (como pBR322) tanto en la membrana del filtro como en la placa principal.
(3) Invierta la placa y cultívela a 37 °C hasta que las colonias marcadas crezcan hasta un ancho de 0,5-65438 ±0,0 mm.
(4) Utilice un La aguja de una jeringa con tinta de dibujo negra resistente al agua penetra en la membrana del filtro hasta llegar al agar y marca en más de tres posiciones asimétricas. Marque la placa base aproximadamente en la misma ubicación.
(5) Sellar la placa principal con parafilm y almacenarla boca abajo a 4°C hasta obtener los resultados de la reacción de hibridación.
(6) Disolver las bacterias y combinar el ADN liberado con el filtro de nitrocelulosa según el método descrito a continuación en este párrafo.
2. Lisis de colonias y unión del ADN al filtro de nitrocelulosa.
(1) Haga una pequeña depresión llena con 0,5 mol/L de NaOH en un trozo de plástico (0,75 ml). Con la colonia hacia arriba, coloque la membrana del filtro en la depresión, aplane la envoltura de plástico para humedecer uniformemente la membrana del filtro y déjela en su lugar durante 2-3 minutos.
(2) Utilice una toalla de papel seca para secar la membrana del filtro desde la parte inferior de la membrana del filtro y repita el paso (1) con una envoltura de plástico nueva y NaOH de 0,5 mol/L recién preparado.
(3) Seque la membrana del filtro y transfiérala a la depresión de una nueva membrana de plástico que contenga 1 mol/L de tris Cl (pH 7,4).
Después de 5 minutos, seque el filtro y repita este paso nuevamente.
(4) Seque la membrana del filtro, transfiérala a una envoltura de plástico que contenga 1,5 mol/L de NaCl y 0,5 mol/L de Tris Cl (pH 7,4) durante 5 minutos, luego succione y seque la membrana del filtro. transfiéralo a un Coloque un trozo de papel de filtro a temperatura ambiente durante 20-30 minutos para secar la membrana del filtro.
(5) Intercale la membrana del filtro entre dos papeles de filtro secos y séquela en una estufa de vacío a 80°C durante 2 horas para fijar el ADN.
(6) Hibridar el ADN fijado en la membrana con la sonda marcada con 32p
Crossover
(1) Utilizar un 2×SSC en una bandeja de plástico , haga flotar la membrana filtrante seca sobre la superficie del líquido y remójela completamente durante 5 minutos.
(2) Transfiera la membrana del filtro a un recipiente de vidrio que contenga 200 ml de solución de prelavado. Apila los filtros y colócalos en la solución. Cubra el plato de vidrio con una envoltura de plástico y colóquelo sobre una plataforma giratoria en la incubadora. Procesar a 50°C durante 30 minutos. Durante este y todos los pasos posteriores, los filtros se deben agitar lentamente para evitar que se peguen.
(3) Limpie suavemente los restos bacterianos de la superficie de la membrana con un pañuelo de papel absorbente empapado en la solución de prelavado para reducir el fondo de hibridación sin afectar la intensidad y claridad de la señal de hibridación positiva.
(4) Transfiera la membrana del filtro a un vaso que contenga 150 ml de solución de prehibridación y prehibride a la temperatura adecuada durante 1 a 2 horas (es decir, hibridación en solución acuosa a 68 °C, 50 % de hibridación de formamida 42°C).
(5) Caliente la sonda de ADN de doble cadena marcada con 32P a 100 °C durante 5 minutos y póngala rápidamente en un baño de hielo. Las sondas monocatenarias no necesitan desnaturalizarse. Agregue la sonda a la bolsa de hibridación e hibride durante la noche. Durante la hibridación, el recipiente que contiene la membrana filtrante debe cerrarse herméticamente para evitar que el líquido se evapore.
(6) Después de la hibridación, retire la solución de hibridación, coloque inmediatamente la membrana del filtro en una solución de gran volumen (300-500 ml) de 2×SSC y 0,1 % de SDS a temperatura ambiente y agite suavemente durante 5 minutos, al menos Invierta el filtro una vez. Repetir la limpieza una vez más evitando que la membrana se seque.
(7) Lave la membrana dos veces con 300-500 ml de 1X SSC y solución de SDS al 0,1 % a 68 °C, 1-1,5 h cada vez. En este momento, se puede realizar la autorradiografía. Si el fondo es muy alto o los requisitos experimentales son estrictos, se pueden usar 300-500 ml de solución de SSC 0,2 × y SDS al 0,1 % para remojar la membrana del filtro a 68 °C durante 60 minutos.
(8) Coloque la membrana filtrante sobre una toalla de papel para que se seque a temperatura ambiente, luego coloque la membrana filtrante (numerada hacia arriba) sobre un trozo de envoltura plástica y haga varias marcas asimétricas en la envoltura plástica para que que La membrana del filtro corresponde a la ubicación de la película de autorradiografía radiactiva.
(9) Cubrir la membrana filtrante con una segunda capa de film plástico. Exponer con película de rayos X y pantalla intensificadora a -70°C durante 12-16 horas.
(10) Una vez revelado el negativo, pega un trozo de cartulina transparente sobre el negativo. Marque la posición de la señal de hibridación positiva en el papel y también marque la posición de los puntos de distribución asimétrica. El papel transparente se puede quitar de los negativos y las colonias positivas se pueden identificar comparando las manchas del papel con las del agar. La hibridación de puntos consiste en detectar muestras de ADN o ARN directamente en filtros de nitrocelulosa y luego hibridar con moléculas sonda de ácido nucleico para mostrar si hay ADN o ARN específico presente en la muestra. Se pueden obtener resultados semicuantitativos diluyendo la misma muestra en diferentes momentos. Por tanto, analizar ADN o ARN es un método sencillo, rápido y económico que se suele utilizar en análisis y diagnóstico genético y es una poderosa herramienta para estudiar la expresión génica. Sin embargo, debido a que la secuencia objetivo no está separada de la secuencia no objetivo, no se puede conocer la longitud de la secuencia objetivo. Especialmente cuando la interferencia de fondo es grande, es difícil distinguir la señal de la secuencia objetivo y la señal de interferencia.
1. Materiales: Muestra de ADN o ARN a analizar, sonda marcada.
2. Equipos: muestreador de artesa, bomba de vacío, baño María a temperatura constante, horno de vacío, etc.
3. Reactivos:
(1) 100% formamida.
(2) Formaldehído (37%).
(3) 20×SSC.
(4)Hidróxido sódico 0,1 mol/L.
(5) Membrana filtrante de nitrocelulosa.
(6) Papel filtro.
4. Pasos de la operación:
(1) Mezcle 10 μl de muestra con 20 μl de formamida al 100 %, 7 μl de formaldehído al 37 % y 2 μl de 20 × SSC.
Después de mezclar, colocar en un baño de hielo a 68°C durante 15 minutos.
(2) Limpie el muestreador con 0,1 mol/L de NaOH y luego enjuáguelo bien con agua esterilizada. Coloque un papel de filtro empapado en 20 × SSC sobre el muestreador, luego coloque una membrana de filtro de nitrocelulosa empapada en 20 × SSC durante 1 hora, cubra y sujete, y encienda la bomba de vacío.
(3) Lavar cada pocillo con 10×SSC. Agregue dos volúmenes de 2×SSC a cada muestra, mezcle y agregue la muestra a los pocillos. Añadir 2 l de tinte a varios pocillos periféricos y pipetear lentamente. Limpie cada pocillo dos veces con 1 ml de 10x SSC. Continúe la aspiración durante 5 minutos y seque el filtro.
(4) Retire la membrana del filtro, colóquela entre dos trozos de papel de filtro y séquela al vacío a 80°C durante 2 horas. Hibridar con sondas radiomarcadas como se describe anteriormente para la hibridación Southern o Northern.
[Nota]
1. Durante la autorradiografía, preste atención a que la membrana del filtro debe estar seca y cubierta con una envoltura de plástico; de lo contrario, la membrana del filtro se pegará a la película de rayos X. , lo que causará problemas en el futuro. La operación trae dificultades.
2. Durante el proceso de hibridación, toda la membrana filtrante debe mantenerse siempre húmeda y no seca.
Sección 3: Optimización de las condiciones y parámetros de la reacción de hibridación
Los efectos de las diferentes condiciones de reacción en los resultados de la hibridación son los siguientes:
(1) Determinar en función de el volumen de solución de hibridación Tiempo de hibridación: en términos generales, es mejor usar un volumen menor de solución de hibridación, porque en un volumen pequeño de solución, el ácido nucleico se empareja más rápido y la cantidad de sonda es menor, por lo que el ADN en el filtro La membrana juega un papel importante en la reacción. Sin embargo, durante el proceso de hibridación, es necesario asegurarse de que haya suficiente solución de hibridación para cubrir la membrana de hibridación.
(2) Determinar la temperatura de hibridación según la solución de hibridación utilizada: Por lo general, cuando la fase de hibridación es una solución acuosa, la hibridación es a 68°C, y cuando es en una solución de formamida al 50%. , la hibridación es a 42°C.
(3) Elegir diferentes reactivos bloqueantes, como el reactivo de Denhardt, la heparina o BLOTTO compuesto por un 5% de leche desnatada en polvo. Estos reactivos requieren la adición de ADN de esperma de salmón alterado o ADN de levadura para su uso con SDS. En comparación con el reactivo de Denhardt, BLOTTO es económico y fácil de usar y puede obtener resultados satisfactorios, pero no puede usarse para la hibridación de ARN. En términos generales, el uso del reactivo de Denhardt en membranas de nailon puede lograr una relación señal-ruido más alta que el uso de BLOTTO. Para los filtros de nitrocelulosa, los reactivos de bloqueo generalmente se incluyen en la solución de prehibridación y en la solución de hibridación. Sin embargo, en el caso de las membranas de nailon, los agentes bloqueantes a menudo se omiten en la solución de hibridación porque las altas concentraciones de proteínas interferirán con la hibridación de la sonda y el gen diana.
(4) Durante el proceso de hibridación, elija diferentes métodos y grados de oscilación según las necesidades. Cuando muchas películas híbridas reaccionan juntas, una ligera oscilación continua puede conducir a mejores resultados de hibridación.
(5) Al agregar otros compuestos durante el proceso de hibridación, como agregar un 10 % de sulfato de dextrano o un 10 % de PEG al sistema de reacción, la velocidad de hibridación se puede aumentar aproximadamente 10 veces. Estos métodos se utilizan a menudo para detectar secuencias raras, pero a veces dan como resultado un fondo alto y son difíciles de manejar debido a la viscosidad de la solución. Por lo tanto, generalmente no se utiliza sulfato de dextrano o PEG a menos que el filtro contenga una pequeña cantidad de ADN objetivo o una cantidad limitada de sonda radiactiva.
(6) Seleccione el grado de limpieza en función de la homología entre la sonda y el objetivo de detección. Si hay una alta homología, puede elegir el modo de elución estricta (SSC de alta concentración); de lo contrario, puede elegir el modo de elución no estricta (SSC de baja concentración). La elución suele realizarse a 12-20°C por debajo de la temperatura de fusión del híbrido. La temperatura de fusión (Tm) es la temperatura del punto medio a la que aumenta la absorbancia cuando las moléculas de ADN o ARN bicatenario se desnaturalizan para formar hebras individuales separadas. Generalmente, las secuencias ricas en pares de bases G C tienen una temperatura Tm más alta que las secuencias ricas en pares de bases AT. Consulte el Capítulo 8 para conocer el método de cálculo de Tm.
(7) Seleccionar diferentes condiciones de hibridación y métodos de detección en función de la concentración y actividad específica de la sonda marcada. En general, se pueden obtener señales potentes utilizando nuevos isótopos.
(8) Al hibridar en solución acuosa, las soluciones 6×SSC y 6×SSPE tienen el mismo efecto. Sin embargo, al hibridar en solución de formamida, se debe utilizar SSPE 6× con mayor capacidad tampón.
Los cambios en estas condiciones tienen diferentes efectos en los resultados de la hibridación, y se debe seleccionar el método apropiado de acuerdo con las condiciones específicas del estudio.