Métodos para determinar la vida y muerte celular

La identificación de células vivas y muertas es de gran importancia en biología y medicina. Para registrar el crecimiento de las células en cualquier momento durante el cultivo celular, es necesario medir con frecuencia la tasa de supervivencia de las células. En el estudio de las células tumorales, para probar la letalidad de diversos fármacos en las células tumorales, también es necesario determinar la tasa de supervivencia de las células tumorales. En medicina clínica, la identificación de células vivas y muertas también tiene grandes aplicaciones. Por ejemplo, para evaluar la fertilidad masculina, un método comúnmente utilizado es medir la motilidad de los espermatozoides.

Existen muchos métodos para identificar células muertas y células viables, incluida la tinción y el análisis instrumental. La tinción es un método común para identificar la vida y muerte celular, y es simple y fácil de operar. Sin embargo, al determinar si las células están vivas o muertas mediante observación morfológica directa, los resultados experimentales se ven fácilmente afectados por los factores subjetivos del operador y existen ciertos errores. Por lo tanto, algunos instrumentos se utilizan a menudo para realizar pruebas de lotes precisas en operaciones reales.

Los diferentes métodos de identificación de células muertas tienen diferentes mecanismos de reacción específicos, pero no importa qué método se utilice, todos aprovechan las diferencias en las funciones y propiedades fisiológicas de las células muertas.

Los métodos más utilizados incluyen la tinción y el análisis instrumental:

1 Método de tinción

Los métodos de tinción se pueden dividir en métodos de tinción química y métodos de tinción fluorescente. Dependiendo del mecanismo de tinción, el tinte puede teñir tanto células muertas como vivas. Las diferencias en funciones y propiedades fisiológicas entre células vivas y células muertas incluyen principalmente:

La diferencia en la permeabilidad de la membrana celular entre células vivas y células muertas: La membrana celular de las células vivas es una membrana selectiva que proporciona protección y barrera a las células. Sólo permite el paso selectivo de sustancias después de la muerte celular, la membrana celular se daña y la permeabilidad aumenta. Un método común utilizado por el azul tripán para diferenciar entre la vida y la muerte de las células es aprovechar esta propiedad. Taiwán se ve azul. También conocido como azul tripán, es un tinte aniónico que no puede penetrar las membranas celulares intactas. Por lo tanto, después de la tinción con azul tripano, solo se pueden teñir las células muertas, pero no las vivas. El azul de metilo también tiene un mecanismo de tinción similar. La plasmólisis en las células vegetales también identifica la vida y la muerte.

La diferencia metabólica entre células vivas y células muertas es la base para identificar las células de levadura con el tinte azul de metileno. El azul de metileno es un tinte no tóxico cuya forma oxidada es azul y su forma reducida es incolora. Debido al metabolismo en las células vivas, las células tienen una fuerte capacidad reductora y pueden oxidar el azul de metileno de azul a una reducción incolora, por lo que las células de levadura vivas teñidas con azul de metileno son incoloras. Las células muertas o las células viejas con metabolismo lento, debido a su capacidad no reductora o a su capacidad reductora extremadamente débil, oxidan el azul de metileno y, por lo tanto, se tiñen de azul o celeste.

El diacetato de fluoresceína (FDA) es un colorante comúnmente utilizado para identificar la viabilidad de protoplastos en cultivos de células animales y vegetales. Su mecanismo de tinción también aprovecha las diferencias metabólicas entre las células vivas y muertas: la propia FDA no produce fluorescencia, no es polar y puede penetrar y salir libremente de la membrana celular intacta. Cuando la FDA ingresa a una célula viva, la lipasa la descompone para producir una sustancia polar que puede producir fluoresceína. No puede penetrar libremente la membrana de la célula viva y se acumula en la membrana celular, lo que hace que la célula viva produzca fluorescencia verde. Sin embargo, las células inactivas no pueden producir fluorescencia porque no pueden descomponer el FDA.

Además, también existen colorantes especiales para algunos orgánulos. Como el rojo neutro, un tinte especial para el sistema vacuolar. El rojo neutro es un tinte poco tóxico que puede enrojecer las vacuolas de las células vivas, pero no tiñe el citoplasma ni los núcleos. Las vacuolas de las células muertas no están teñidas o están ligeramente teñidas, el tinte se dispersa por toda la célula y el núcleo y el citoplasma se tiñen de rojo. A veces, para aumentar el efecto del teñido, se pueden mezclar dos tintes, como el teñido mixto azul de metilo y rojo neutro.

2 métodos de análisis de instrumentos

La tecnología de microelectrodos (que utiliza la diferencia de potencial entre la membrana de la célula viva y la membrana de la célula muerta), el contador de células automático y el citómetro de flujo pueden detectar con precisión la vida y Muerte de células en lotes.

El analizador de células/contador de células/analizador de células CEDEX totalmente automático producido por INNOVATIS, Alemania, es el primer analizador de células de escaneo (patentado) de alta resolución y alta definición del mundo con tinción automática con azul tripán y CCD microscópico. software de estación de trabajo Cedex y de imágenes, que se puede utilizar para el recuento y análisis de células en I+D y producción industrial en productos farmacéuticos, atención médica, fermentación, inmunidad, patología, pruebas de toxicidad, biotecnología y otras disciplinas. Resultados del análisis automático, salida de datos de detección y análisis (11 elementos): número total de células, concentración celular total (células/ml), número y concentración de células vivas (células/ml), número y concentración de células muertas (células/ml); ); tasa de viabilidad de las células (%); histograma de redondez de las células; gráfico de tiempo de crecimiento de las células;

Hay dos tipos de sondas fluorescentes comúnmente utilizadas en los citómetros de flujo para determinar la vida y muerte celular: una es una sustancia que puede penetrar la membrana de las células vivas y emitir fluorescencia. Por ejemplo, la FDA puede estar contenida en células vivas y emitir una fluorescencia de color amarillo verdoso. Si la célula está dañada, desaparecerá de la célula y no se podrá observar la fluorescencia. El otro tipo no puede penetrar la membrana de las células vivas, pero puede teñir los núcleos de las células fijas y de las células con membranas dañadas. Por ejemplo, el yoduro de propidio (PI) y el bromuro de etidio (EB) se utilizan habitualmente como sondas fluorescentes de segundo tipo. El yoduro de propidio (PI) no puede penetrar la membrana celular y no puede teñir células normales o células apoptóticas con membranas celulares intactas.

Para las células necróticas, donde se pierde la integridad de la membrana celular, el yoduro de propidio (PI) puede teñir las células necróticas. Los kits de detección de apoptosis y necrosis utilizados actualmente contienen Hoechst 33342 y yoduro de propidio (PI). Cuando se produce la apoptosis, la cromatina se reduce, Hoechst 33342 puede penetrar la membrana celular y la fluorescencia de las células apoptóticas mejorará significativamente después de la tinción. Después de la doble tinción con dos tintes, las células normales muestran una fluorescencia roja débil + una fluorescencia azul débil, las células apoptóticas muestran una fluorescencia roja débil + una fluorescencia azul fuerte y las células necróticas muestran una fluorescencia roja fuerte + una fluorescencia azul fuerte.