Genética inversa: el sistema de 8 plásmidos rescata el virus de la influenza A
La genética inversa, la generación de virus a partir de copias completas de ADNc del genoma viral, se conoce como "clonación infecciosa" y es una de las herramientas genéticas más poderosas de la virología moderna. La tecnología del ADN recombinante nos permite analizar y manipular genomas a nivel molecular. Sin embargo, para los virus de ARN no retrovirales, el genoma no entra en la etapa de ADN durante la replicación, y la manipulación directa de genes de ARN frágiles es un desafío. El genoma de los virus de la influenza está segmentado y tiene cadenas negativas, por lo que la manipulación genética de los virus de la influenza es más exigente.
Para servir como plantilla funcional para iniciar la transcripción y replicación, el ARN del virus de la influenza (ARNv) debe transcribirse en ARNm de sentido positivo mediante un complejo de polimerasa, que incluye tres polimerasas virales (PB2, PB1, y PA) y proteína nuclear (NP). Los virus de la influenza tienen un genoma compuesto por ocho segmentos de genes de ARN que deben expresarse y empaquetarse para completar el ciclo de replicación viral.
El sistema genético inverso del virus de la gripe fue establecido en 1999 por dos grupos de investigación diferentes, basándose en la ARN polimerasa I (Pol I) intracelular para sintetizar el ARN del virus de la gripe. La ARN polimerasa I es una ribozima abundante que transcribe el ARN ribosómico. La ARN polimerasa I inicia y termina la transcripción en secuencias promotoras y terminadoras definidas, y la transcripción resultante no contiene nucleótidos adicionales en los extremos 5' o 3'. Por lo tanto, esta enzima es muy adecuada para producir ARNv del virus de la influenza en el núcleo. Aunque los sistemas de rescate del virus de la influenza mejoran constantemente, el concepto básico de utilizar el sistema de ARN polimerasa I para sintetizar ARNv sigue siendo el mismo.
En la actualidad, la síntesis de novo de los virus de la gripe se consigue principalmente transfectando células con 8-12 plásmidos. Entre ellos, el sistema de 8 plásmidos es el más utilizado para rescatar los virus de la influenza A. Ocho plásmidos contienen promotores y terminadores que codifican la ARN polimerasa I, y entre los promotores y terminadores se encuentran los ADNc para cada genoma segmentado del virus de la influenza. Las proteínas del sistema de 8 plásmidos son transcritas y traducidas por Pol II, y este sistema necesita expresar al menos 4 proteínas (PA, PB1, PB2 y NP). Un sistema general de 8 plásmidos puede transcribir 8 genes del virus de la influenza y traducir 10 proteínas del virus de la influenza. La traducción de las proteínas completas del virus de la influenza puede mejorar la eficiencia del rescate del virus de la influenza.
protocolo:
Clonación de 8 plásmidos:
Utilice un vector que contenga la secuencia polⅠ humana como vector de expresión del sistema de rescate para construir un rescate de 8 plásmidos sistema. Este vector es un vector de expresión dual bidireccional, en el que el promotor pol I humano y la secuencia de terminación pol I de ratón se insertan a la inversa entre el promotor pol II (CMV) y la secuencia de terminación (SV40). Se insertan ocho ADNc del virus de la influenza (incluidos UTR y ORF) en el vector. Después de la transfección en las células, la pol I es responsable de sintetizar el ARN monocatenario de cadena negativa del virus de la influenza y la pol II es responsable de la transcripción de la cadena positiva del virus de la influenza. ARNm y posteriormente traducir proteínas del virus de la influenza. Este plásmido es especial porque tiene colas poliA antes y después del fragmento insertado. Para la secuenciación no se pueden secuenciar con cebadores universales.
Rescatar el virus de la influenza A:
1. Inocular HEK-293T en una placa de 6 pocillos y cultivar hasta obtener al menos un 95 % de confluencia durante 24 horas.
Nota: Dado que la transfección agregará una gran cantidad de reactivos de transfección tóxicos, las células deben estar en buenas condiciones y la cantidad requerida es grande. Debido a la especificidad de especie del promotor pol I humano, sólo se pueden utilizar células derivadas de primates (células 293T o Vero) con alta eficiencia de transfección para empaquetar el virus de la influenza. En términos generales, el efecto de rescate del 293T es más fuerte que el de Vero. Debido a que las células MDCK apoyan el crecimiento de muchos virus de la influenza y pueden cultivarse en el mismo medio de cultivo que las células 293T, se pueden usar células 293T-MDCK cultivadas exclusivamente (1:1) para mejorar la eficiencia de rescate de ciertas cepas del virus de la influenza.
2. En medio de cultivo DMEM (sin FBS), agregue 1 μg de cada plásmido, 8 μg en total para 8 plásmidos, mezcle con el reactivo de transfección y deje reposar a temperatura ambiente durante 15-30 minutos.
Nota: Plásmido: liposoma=1:3; Plásmido: PEI=1:4. DMEM se puede reemplazar con Opti-MEM.
3. Reemplace el medio DMEM (que contiene FBS) de HEK-293T y deje caer lentamente el complejo reactivo de transfección de plásmido en la placa de 6 pocillos.
4. Cultivar las células en una incubadora a 37°C que contenga 5% de dióxido de carbono.
Nota: También se aceptan ambientes a 35 ℃.
5. 24 horas después de la transfección, añadir tripsina tratada con TPCK con una concentración final de 1μg/ml y continuar cultivando.
Nota: La tripsina TPCK se utiliza para escindir la proteína HA del virus de la gripe, haciendo que el virus sea infeccioso. Algunas cepas de virus no requieren esta tripsina.
6. 48 horas o 72 horas después de la transfección, recoger el sobrenadante de células HEK-293T. En este momento, el virus de la influenza está en el sobrenadante, pero el título es extremadamente bajo.
Nota: La congelación y descongelación repetidas de las células tres veces ayudará a liberar los virus de la influenza en las células.
7. Suelte el sobrenadante recogido en células MDCK y el virus de la gripe infectará las células MDCK para su amplificación.
Nota: También es necesario añadir tripsina tratada con TPCK con una concentración final de 1μg/ml. El cultivo del virus de la gripe en embriones de pollo es extremadamente eficaz: se inocula en embriones de pollo SPF de 9 a 11 días de edad. Se recogió líquido amnioalantoideo después de 48 horas de incubación. La presencia de virus infecciosos puede confirmarse mediante la prueba de hemaglutinina (HA).
8. 48 horas después de la infección, recoger el sobrenadante de células MDCK y realizar un ensayo de placa para determinar el título del virus.
Nota: El título medido generalmente es de alrededor de 5x10^6Pfu/ml. Si desea aumentar el título del virus de la influenza, continúe infectando MDCK con el virus para su amplificación.
9. La identidad del virus rescatado debe confirmarse secuenciando cada uno de los 8 segmentos del gen viral.
10. El líquido viral se puede almacenar a 4 ℃ durante varias semanas. -80 ℃ se pueden almacenar durante mucho tiempo.
Referencias:
1. Liu Liqi. Estudio preliminar sobre la patogenicidad del virus de la influenza aviar HgN2 y la construcción del sistema genético inverso [D].
2. Lee C W. Genética inversa del virus de la influenza [M]//Virus de la influenza animal Humana Press, Nueva York, NY, 2014: 37-50.