Marcado no radiactivo de sondas de oligonucleótidos
Para el marcaje no radiactivo de sondas de oligonucleótidos, se pueden utilizar los siguientes métodos
1. El método de extensión enzimática sintetiza una secuencia de oligonucleótidos complementaria al extremo 3' del gen objetivo de la sonda. Se añade una A adicional al extremo 5' de esta secuencia para hibridar con el fragmento del gen objetivo y luego se extiende con Klenow. enzima para producir bio-dUTP Incorporar el extremo 3' de la sonda.
2. Método de marcado del extremo con fosfato 5': las sondas oligonucleotídicas con fosfato 5' se tratan con carbodiimida (EDC) soluble en agua en tampón de imidazol para generar fosfato de imidazol activo, reaccionando con un exceso de etilendiamina. , puede introducir un brazo portador de amino. Las sondas de oligonucleótidos marcadas con fosfato 5' se pueden obtener marcando con biotina activada.
3. El método de sonda marcada con enzima utiliza un conector bifuncional como el éster de bishidroxisuccinimida del ácido subérico para unir oligonucleótidos y fosfatasa alcalina para generar una sonda de oligonucleótido marcada con enzima 1:1. Este método omite el paso intermedio biotina-avidina y puede reducir reacciones no específicas.
4. Método de modificación de citosina con biotina hidrazida. Bajo la catálisis del sulfito, la biotina hidrazida puede reemplazar el grupo amino de la citosina en la sonda de oligonucleótidos para obtener una sonda de oligonucleótidos biotinilada.
5． El método de marcaje enzimático de oligonucleótidos permite añadir nucleótidos modificados con sustancias no radiactivas (biotina dATP; biotina-dUTP; digoxigenina-dUTP) a 3 del ADN bajo la acción de la transferasa terminal. Al final, de 10 a 20 bases modificadas. Se puede añadir ADN a cada sonda.
(1) Tome un tubo de centrífuga de plástico siliconado de -0,5 ml, insértelo en un baño de hielo, agregue oligonucleótido (3 pmol) × μl, 20 μl de tampón de cola 5 ×, 4 μl de 5,0 mmol/ l dUTP (concentración final 200 μmol/L), dNTP modificado (biotina-dUTP; biotina-dATP; digoxigenina-dUTP) × μl (concentración final 100 μmol/L), agregar a 100 μl, mezclar y agregar 5u de transferasa terminal. Reaccionar a 37°C durante 1 hora.
(2) Purificación de la sonda: método de precipitación con etanol: añadir 50 μg de ARNt, 15 μl de acetato de sodio de 4 mol/l y 375 μl de etanol absoluto, mezclar a -20 °C durante 1 h, centrifugar a alta velocidad durante 10 min, desechar el sobrenadante, Lavar el precipitado repetidamente con etanol al 70% y etanol absoluto, secarlo y luego disolverlo en agua hasta una concentración de 500 ng/ml.